ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

Objetivos
La presente Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio in vitro de la proteína aislada de PsbQ
de Spinacia oleracea, como representante de plantas superiores. El conocimiento en el año 2000
de esta proteína era muy excaso pues poco se conocía acerca de su estructura y parámetros de
estabilidad. Por ello, nos propusimos como objetivos para este trabajo:
- Análisis evolutivo de las proteínas extrínsecas del OEC en los diferentes organismos
oxifotosintéticos. Se estudiará la presencia o ausencia de PsbQ y del resto de las subunidades
extrínsecas y su entorno analizando los genomas completos depositados en las bases de datos
públicas, con el fin de conocer la distribución de las mismas e intuir una relación evolutiva.
- Obtención de proteína PsbQ pura y homogénea. Se pondrá a punto un protocolo de
obtención de la proteína PsbQ nativa, utilizando Cu 2+ , para así evitar los problemas tradicionales
de degradación de la misma por la activación durante el proceso de purificación de proteínas con
actividad prolil-endopeptidasa. Para mejorar el rendimiento en la obtención, se desarrollará un
método de sobreexpresión y purificación de la proteína PsbQ recombinante en E. coli a partir
del clon pSoc16.11 de PsbQ de espinaca cedido por el Prof. R.G. Herrmann.
- Estudio estructural de PsbQ, haciendo uso de diferentes técnicas bioinformáticas
actualmente disponibles. Para ello, se realizará una búsqueda de homólogos de secuencia en la
base de datos, una predicción de estructura secundaria por redes neuronales y una predicción
de plegamiento por threading. Este análisis se completará con un análisis estructural de
estructura secundaria y terciaria por técnicas espectroscópicas (absorción, fluorescencia,
dicroísmo circular e infrarrojos con transformada de Fourier). Paralelamente, se procederá a la
obtención de cristales de PsbQ susceptibles de difracción de rayos-X, recogida de datos
cristalográficos y análisis de los mismos con el fin de obtener una imagen 3D de la proteína que
se comparará con la estructura predicha computacionalmente.
- Estudio de la estabilidad conformacional de PsbQ, realizando experimentos de
desnaturalización por agentes químicos (GdnHCl) y por temperatura. Se hará uso de técnicas
espectroscópicas (dicroísmo circular y fluorescencia) y de técnicas calorimétricas (calorimetría
diferencial de barrido). Se procederá a la caracterización de los parámetros termodinámicos de
PsbQ in vitro.
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