ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

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46 Materiales y Métodos En las predicciones se utilizó siempre la secuencia de aminoácidos de PsbQ de espinaca como guía. Esta secuencia se obtuvo de la base de datos SWISSPROT (Gasteiger et al, 2001) donde se identifica con el código de acceso P12301 o PSBQ_SPIOL. Se realizó una búsqueda de homología de secuencia (>30 %) en las bases de datos públicas usando el algoritmo de búsqueda de BLASTP (Altschul et al, 1997), que se basa en la búsqueda de regiones de similitud local. Los programas de búsqueda de secuencias homólogas muestran la confianza estadística de sus resultados con un valor numérico P(N), que oscila entre 0 y 1, y que representa la probabilidad de que el resultado obtenido se deba al azar. Por tanto, un valor de P(N) muy próximo a 0 es un valor muy fiable, mientras que cuanto más próximo se encuentre a 1 más probabilidad tiene de ser un falso positivo. Esta probabilidad también se puede expresar en forma de un valor llamado “e” (“e-value”) que a valores menores de 10 -5 , aproximadamente, coincide numéricamente con P(N). Se escogieron como homólogas aquellas secuencias con P(N) ≤ 10 -4 . De estas secuencias se eliminó el péptido señal y se realizó un alineamiento múltiple con el programa CLUSTALX (Thompson et al, 1997) de la proteína madura, con posterior análisis por inspección visual. Además, se buscaron homólogos remotos (20-30%) usando los algoritmos de PSI-BLAST (Altschul et al, 1997), basado en la construcción de perfiles numéricos a partir de búsquedas simples de BLAST, y HMMer (Durbin et al, 1998), que utiliza modelos estadísticos de cadenas de Markov, de forma independiente. Se incluyeron en el alineamiento aquellas secuencias con valor de “e” menor o igual a 10 -5 . Se comprobó la homología realizando búsquedas cruzadas. Todas estas búsquedas se hicieron con los parámetros por defecto y en la base de datos no redundante (nrdb) que elimina la redundancia de secuencias idénticas y proporciona una colección de casi todas las proteínas conocidas. Las secuencias obtenidas por los métodos anteriores se alinearon combinando el alineamiento de secuencias con el de perfiles, según familias, con CLUSTALX (Thompson et al, 1997). El alineamiento múltiple final se utilizó para una nueva búsqueda por HMMer (Durbin et al, 1998) sobre la base de datos no redundante de proteínas. Se construyó un árbol filogenético por el método de Neighbor-joining y se evaluó la estabilidad de sus nodos por el método de boostrapping con el programa PHYLIP (Felsentein, 2002). Para la predicción de estructura secundaria se incluyó el alineamiento de la familia ya que se ha comprobado que el uso de información procedente de alineamientos múltiples aumenta considerablemente la exactitud de la predicción (Hannenhalli & Russell, 2000). Los métodos que se utilizaron para la predicción fueron:
Materiales y Métodos -PROF (Rost, 2001): algoritmo de predicción de estructura secundaria (PHDsec) y accesibilidad del disolvente (PHDacc). Utiliza un sistema de varias redes neuronales basado en perfiles construidos a partir de un alineamiento múltiple, generado automáticamente por Maxhom (Sander & Schneider, 1991) según los resultados obtenidos por una búsqueda en PSIBLAST o aportado por el usuario (http://maple.bioc.columbia.edu/predictprotein/). -PSIPRED (Jones, 1999): algoritmo de predicción de estructura secundaria a partir de un sistema de redes neuronales combinado con un alineamiento múltiple generado automáticamente a partir de los resultados obtenidos por una búsqueda con PSIBLAST. El paso más importante del método es la estrategia diseñada para evitar acumulación de proteínas no relacionadas en el perfil (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/). -JPRED (Cuff et al, 1998): método que combina los resultados de distintos programas de predicción de estructura secundaria y a partir de éstos genera un consenso. La predicción la realiza o bien sobre un alineamiento múltiple de secuencias que aporta el usuario o generado automáticamente por CLUSTALW a partir de los resultados obtenidos por PSIBLAST (http://jura.ebi.ac.uk:8888/). -SSPRO (Baldi et al, 1999): método que utiliza una red neural recurrente bidireccional combinado con un alineamiento múltiple generado automáticamente a partir de los resultados obtenidos por una búsqueda con PSIBLAST (http://promoter.ics.uci.edu/BRNN-PRED). Estos métodos clasifican cada aminoácido según tres posibles estados de estructura secundaria: α-hélice, hoja-β u otro. A la predicción de cada residuo se le asigna un índice de fiabilidad, que varía entre 0 y 9, y que se correlaciona con la exactitud de la predicción. Este índice nos permite identificar las regiones de la proteína que se han predicho con mayor exactitud (Rost, 2001). La evaluación de estos métodos se realiza semanalmente por el servidor automático EVA (Koh et al, 2003) a partir del número de residuos predichos correctamente (Tabla II). MÉTODO Q 3 PROF 75 PSIPRED 75.8 JPRED 72.8 SSPRO 74.3 Tabla II. Evaluación media de los métodos de PROF, PSIPRED, JPRED y SSPRO, de predicción de estructura secundaria, por el servidor automático EVA. Esta evaluación queda reflejada en el valor Q3 (Q3=positivos verdaderos+negativos verdaderos /total de residuos). 47
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