ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA EXTRÍNSECA PsbQ ...

2.2. Expresión de la proteína PsbQ de espinaca recombinante y purificación.
2.2.1. Construcción del vector de expresión.
Resultados
Con objeto de expresar la proteína PsbQ madura se amplificó por PCR el cDNA de la proteína
PsbQ clonada en pSoc16.11 y se clonó el cDNA de psbQ maduro en el vector de expresión
pET12a, construcción que se denominó JR2592. La región ompT de este vector, que codifica la
proteína de membrana externa OmpT, se eliminó usando las enzimas de restricción Nde I y
BamHI, de manera que en JR2592 no hubo fusión entre las proteínas PsbQ y OmpT. De esta
forma, la proteína recombinante se acumuló en el espacio citoplasmático de E.coli
BL21(DE3)pLysS. El oligonucleótido utilizado para la amplificación incluía el codón de iniciación
ATG formando parte del sitio de restricción de NdeI. La proteína recombinante así obtenida
tenía una secuencia idéntica a la depositada en la base de datos de SWISSPROT
(PSBQ_SPIOL), excepto por la metionina inicial.
2.2.2. Expresión y purificación de PsbQ recombinante.
La sobreexpresión de PsbQ recombinante se indujo a una densidad óptica de 1.2 cm -1 a 550 nm y
el tiempo de incubación fue de 15-18 h a 28 ºC. Las células se resuspendieron y sonicaron en 0.8
M Tris-HCl pH 8.4 con el fin de mimetizar uno de los tampones de lavado usados en la
eliminación de las proteínas extrínsecas del PSII unidas a la superficie de la membrana del
tilacoide (Ljungberg et al, 1983).
El proceso de purificación fue similar al utilizado para PsbQ nativa. El primer pase
cromatográfico se realizó en una columna de intercambio catiónico HiTrap SP (Amersham
Pharmacia) donde el punto isoeléctrico básico de PsbQ (∼9.2) vuelve a ser una ventaja para este
proceso de purificación. Se consiguió una disolución de PsbQ de una pureza, aproximadamente,
del 90 %. El segundo paso de la purificación se realizó en una columna de filtración Superdex
200 (Amersham Pharmacia). La disolución obtenida de PsbQ fue de una pureza superior al 95 %.
Específicamente, para el análisis de PsbQ por espectroscopía de infrarrojos se sustituyó el
tampón inicial, que contenía 20 mM Tris-HCl pH 8.0, por otro tampón, que contenía 20 mM
K 2HPO 4/KH 2PO 4 pH 8.0. En el gel (Figura 24B, d) no se identificaron productos de degradación
de PsbQ recombinante en estas muestras. El rendimiento medio usando este procedimiento para
la obtención de PsbQ nativa se estimó en 10-12 mg de proteína por 1 L de cultivo de partida.
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