(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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도 61에서는 위약, 80, 160, 그리고 320 ㎎ 투약 농도 군에 대한 HAQ-DI 스코어에서 변화를 도시한다.
도 62에서는 위약, 80, 160, 그리고 320 ㎎ 투약 농도 군에 대한 DAS28 스코어에서 변화를 도시한다.
도 63에서는 위약, 80, 160, 그리고 320 ㎎ 투약 농도 군에서 EULAR 우수한 또는 온건한 반응을 달성하는 환자
의 비율에서 변화를 도시한다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
실시예
아래의 실시예에서, 용어 "Ab1"은 달리 명시되는 경우를 제외하고, 서열 번호: 702의 경쇄 서열 및 서열 번호:
704의 중쇄 서열을 포함하는 항체를 지칭한다.
실시예 1 농축된 항원-특이적 B 세포 항체 배양액의 생산
항체의 패널은 목적되는 표적 항원에 대한 본래의 면역 반응을 유도하기 위하여 전통적인 항체 숙주 동물을 면
역화시킴으로써 도출된다. 전형적으로, 면역화에 이용되는 숙주는 토끼, 또는 유사한 성숙 과정을 이용하여 항
체를 생산하고 필적하는 다양성, 예를 들면, 에피토프 다양성의 항체를 생산하는 항원-특이적 B 세포의 집단을
제공하는 다른 숙주이다. 최초 항원 면역화는 완전 Freund 어쥬번트(CFA)를 이용하여 수행될 수 있고, 그리고
차후 부스트(boost)는 불완전 어쥬번트로 달성될 수 있다. 면역화후 대략 50-60일, 바람직하게는 55일 시점에,
항체 역가가 조사되고, 그리고 적절한 역가가 확립되면 항체 선별(ABS) 과정이 시작된다. ABS 시작을 위한 2가
지 핵심 기준은 강력한 항원 인식 및 다중클론 혈청 내에서 기능-변화 활성이다.
양성 항체 역가가 확립되는 시점에서, 동물은 희생되고 B 세포 공급원이 분리된다. 이들 공급원에는 비장, 림프
절, 골수, 그리고 말초혈 단핵 세포(PBMC)가 포함된다. 단일 세포 현탁액이 산출되고, 그리고 이들 세포 현탁액
은 낮은 온도 장기 보관에 적합하도록 세척된다. 이들 세포는 이후, 전형적으로 동결된다.
항체 확인 과정을 시작하기 위하여, 적은 분획물의 동결된 세포 현탁액은 해동되고, 세척되고, 그리고 조직 배
양액 배지에 배치된다. 이들 현탁액은 이후, 동물 면역 반응을 생성시키는데 이용되는 항원의 비오틴화된 형태
와 혼합되고, 그리고 항원-특이적 세포는 Miltenyi 자석 비드 세포 선별 방법을 이용하여 회수된다. 스트렙타비
딘 비드를 이용하여 특이적 농축이 수행된다. 농축된 집단은 회수되고 특이적 B 세포 분리의 다음 단계에서 처
리된다.
실시예 2 클론성, 항원-특이적 B 세포-포함 배양액의 생산
실시예 1에 따라 생산된 농축된 B 세포는 이후, 96웰 마이크로역가 평판에서 웰당 다양한 세포 밀도에서 도말된
다. 일반적으로, 이는 군당 10개 평판으로 웰당 50, 100, 250, 또는 500개 세포이다. 배지는 50K 동결되고 조사
된 EL4B 지지 세포(feeder cell)와 함께, 4% 활성화된 토끼 T 세포 조건 배지로 보충된다. 이들 배양액은 5-7일
동안 방해 없이 방치되고, 이 시점에서 상층액-포함 분비된 항체가 수집되고 독립된 분석 환경에서 표적 특성에
대하여 평가된다. 나머지 상층액은 본래대로 방치되고, 그리고 평판은 -70℃에서 동결된다. 이들 조건 하에, 배
양 과정은 전형적으로, 항원-특이적 B 세포의 클론 집단을 포함하는 혼합된 세포 집단을 포함하는 웰을 발생시
킨다, 다시 말하면, 단일 웰은 원하는 항원에 특이적인 단일 단일클론 항체만을 포함할 것이다.
공개특허 10-2011-0112308
실시예 3 원하는 특이성 및/또는 기능적 특성의 단일클론 항체에 대한 항체 상층액의 스크리닝
실시예 2에 따라 생산된 클론 항원-특이적 B 세포 집단을 포함하는 웰로부터 유래된 항체-포함 상층액은
초기에, ELISA 방법을 이용하여 항원 인식에 대하여 스크리닝된다. 이는 선택성 항원 고정화(가령, 스트렙타비
딘 코팅된 평판에 의한 비오틴화된 항원 포획), 비-특이적 항원 평판 코팅, 또는 대안으로, 항원 구축 전략(가
령, 선택성 항원 포획, 그 이후에 이형(heteromeric) 단백질-항원 복합체를 생성시키기 위한 결합 파트너 부
가)을 포함한다. 항원-양성 웰 상층액은 이후, 리간드에 엄격하게 의존하는 기능-변화 분석에서 선택적으로 조
사된다. 이와 같은 한 가지 실례는 재조합 수용체 단백질로 항원 리간드의 자연적인 상호작용을 재현하는 시험
관내 단백질-단백질 상호작용 분석이다. 대안으로, 리간드 의존성이고 용이하게 모니터되는 세포-기초된 반응
(가령, 증식반응)이 이용된다. 현저한 항원 인식과 효능을 보이는 상층액은 양성 웰인 것으로 간주된다. 최초
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