(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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배양액은 5일 내지 7일 사이에 항원 인식 및 기능적 활성에 대하여 조사되었다.
항원 인식 스크리닝
이용된 ELISA 형식은 B 세포 배양액(BCC) 웰(모두 30개 평판)로부터 50 ㎕의 상층액이 항체의 공급원으로서 이
용된 점을 제외하고 앞서 기술된 바와 동일하다. 상기 조건 배지는 항원-코팅된 평판으로 이동되었다. 양성 웰
이 확인된 이후, 상층액은 제거되고 96-웰 마스터 평판(들)으로 이동되었다. 이들 초기 배양액 평판은 이후, 40
㎕/웰을 제외하고 모든 상층액을 제거하고 FBS에서 60 ㎕/웰의 16% DMSO를 첨가함으로써 동결되었다. 평판은 동
결을 지연시키기 위하여 종이 타월로 감싸지고 -70℃에 배치되었다.
기능적 활성 스크리닝
마스터 평판은 이후, 열 B가 배경 대조에 대한 배지이고, 열 C가 양성 증식 대조에 대한 배지 + IL-6이고, 그리
고 열 D-G 및 칼럼 2-11이 BCC(50 ㎕/웰, 단일 점)로부터 웰인 점을 제외하고, 앞서 기술된 바와 같은 T1165 증
식 분석에서 기능적 활성에 대하여 스크리닝되었다. 40 ㎕의 IL-6이 상기 분석에서 결정된 EC50 농도의
2.5배로, 상기 배지 열을 제외한 모든 웰에 첨가되었다. 1시간 배양후, Ab/Ag 복합체는 조직 배양액(TC)
처리된, 96-웰, 편평-바닥 평판으로 이동되었다. huIL-6(20,000개 세포/웰에서 T1165)이 없는 변형된 RPMI 배지
에서 20 ㎕의 세포 현탁액이 모든 웰(웰당 100 ㎕ 최종 부피)에 첨가되었다. 배경은 뺄셈되고, 그리고 관찰된
OD 값은 저해 %로 변환되었다.
B 세포 회수
목적되는 웰을 포함하는 평판은 -70℃로부터 이전되고, 그리고 각 웰로부터 세포는 5-200 ㎕ 배지/웰의 세척액
으로 회수되었다. 이들 세척액은 1.5 ㎖ 무균 원심분리 튜브 내에 모아지고, 그리고 세포는 1500 rpm에서 2분
동안 작은 알로 뭉쳐졌다.
상기 튜브는 뒤집어지고, 회전은 반복되고, 그리고 상층액은 조심스럽게 제거되었다. 세포는 100 ㎕/튜브의 배
지에서 재현탁되었다. 배지에서 1:100 희석된 100 ㎕ 비오틴화된 IL-6 코팅된 스트렙타비딘 M280
dynabead(Invitrogen) 및 16 ㎕의 염소 항-토끼 H&L IgG-FITC가 세포 현탁액에 첨가되었다.
20 ㎕의 세포/비드/FITC 현탁액은 제거되고, 그리고 Sigmacote(Sigma)로 미리 처리된 유리 슬라이드(Corning)
상에서 5 ㎕ 비말이 35 내지 40개 비말/슬라이드로 만들어졌다. 이들 비말을 물에 담그기 위하여 파라핀 오일
(JT Baker)의 불침투성 장벽이 첨가되고, 그리고 37℃, 4% CO2에서 어둠 하에 90분 동안 상기 슬라이드가 배양
되었다.
항체를 생산하는 특이적 B 세포는 항체 분비로 인한 그들 주변에 형광 고리, 비드-결합된 비오틴화된 항원의 인
식, 그리고 형광-IgG 검출 시약에 의한 차후 검출에 의해 확인될 수 있다. 일단 목적되는 세포가 확인되면, 형
광 고리의 중심에서 세포는 미세조작기(Eppendorf)를 통해 회수되었다. 항체를 합성하고 이출하는 단일 세포는
250 ㎕ 마이크로원심분리 튜브 내로 이전되고 드라이아이스에 배치되었다. 목적되는 모든 세포를 회수한 이후,
이들은 장기 보관을 위하여 -70℃로 이전되었다.
실시예 8 효모 세포 발현
공개특허 10-2011-0112308
항체 유전자: 키메라 인간화된 토끼 단일클론 항체의 합성을 주동하는 유전자가 클로닝되고 작제되었다.
발현 벡터: 본 벡터는 아래의 기능적 성분을 포함한다: 1) 대장균(Escherichia coli)의 세포 내에서 플라스미드
벡터의 복제를 조장하는 돌연변이 ColE1 복제 기점; 2) 항생제 Zeocin(플레오마이신)에 대한 내성을
공여하고, 그리고 대장균(E. coli)과 피치아 파스토리스(P. pastoris) 둘 모두의 형질전환에 대한 선별가능 마
커로서 기능하는 세균 Sh ble 유전자; 3) 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 알파 교배 인
자 프리 프로 분비 리더 서열을 인코딩하는 서열, 그 다음에 피치아 파스토리스(P. pastoris) 알코올 산화효소
I 유전자(AOX1)로부터 피치아 파스토리스(P. pastoris) 전사 종결 신호를 인코딩하는 서열에 융합된 글리세르알
데히드 탈수소효소(glyceraldehyde dehydrogenase) 유전자(GAP 유전자) 프로모터로 구성되는 발현 카세트.
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