(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

[0764]
[0765]
[0766]
[0767]
[0768]
[0769]
[0770]
Zeocin(플레오마이신) 내성 마커 유전자는 더욱 높은 수준의 Zeocin(플레오마이신)에 내성을 갖는 형질전환
체를 선별함으로써, 균주 내에서 발현 벡터의 복수 통합된 사본을 포함하는 균주에 대한 농축의 수단을 제공한
다.
피치아 파스토리스(P. pastoris) 균주: 피치아 파스토리스(P. pastoris) 균주 met1, lys3, ura3과 ade1이 이용
될 수 있다. 임의의 2가지 상보성 세트의 영양요구성 균주가 2배체 균주의 작제와 유지에 이용될 수 있긴 하지
만, 이들 두 균주는 2가지 이유로 본 발명의 방법에 특히 적합하다. 첫째, 이들 균주는 그들의 교배 또는 융합
의 결과물인 2배체 균주보다 더욱 느리게 성장한다. 따라서 적은 숫자의 반수체 ade1 또는 ura3 세포가 배양액
내에 존재하거나, 또는 감수분열 또는 다른 기전을 통하여 발생하면, 2배체 균주는 배양액 내에서 이들보다 빨
리 자란다.
둘째, 교배로부터 발생하는 2배체 Ade+ 콜로니는 정상적인 백색 또는 크림색인 반면, 반수체 ade1 돌연변이체인
임의의 균주의 세포는 독특한 핑크색을 갖는 콜로니를 형성할 것이기 때문에, 이들 균주의 성적 상태를 모니터
하는 것이 용이하다. 이에 더하여, 반수체 ura3 돌연변이체인 임의의 균주는 약물 5-플루오르-오로틴산(FOA)에
내성이고 FOA를 포함하는 최소 배지 + 우라실 평판 상에 배양액의 시료를 도말함으로써 민감하게 확인될 수 있
다. 이들 평판에서, 우라실-요구 ura3 돌연변이(아마도 반수체) 균주만 성장하고 콜로니를 형성할 수 있다. 따
라서 ade1과 ura3으로 표기된 반수체 모 균주로, 결과의 항체-생산 2배체 균주의 성적 상태를 용이하게 모니터
할 수 있다(반수체 대(對) 2배체)
방법
경쇄와 중쇄 항체 유전자의 전사를 위한 pGAPZ-알파 발현 벡터의 작제. 인간화된 경쇄와 중쇄 단편은 PCR 주동
된 과정을 통해 pGAPZ 발현 벡터 내로 클로닝되었다. 회수된 인간화된 구조체는 아래의 프라이머 (1) 경쇄 전방
AGCGCTTATTCCGCTATCCAGATGACCCAGTC(AfeI 부위는 단일 밑줄로 표시됨)를 이용하는 표준 KOD 중합효소(Novagen)
키트 조건((1) 94℃, 2분; (2) 94℃, 30초; (3) 55℃, 30초; (4) 72℃, 30초-35회 동안 단계 2-4 사이클링;
(5) 72℃ 2분) 하에 증폭에 종속되었다. HSA 신호 서열의 끝은 이중 밑줄로 표시되고, 그 다음에 성숙 가변 경
쇄에 대한 서열(밑줄로 표시되지 않음); 역방 CGTACGTTTGATTTCCACCTTG가 위치한다.
가변 경쇄 후방 프라이머. BsiWI 부위가 밑줄로 표시되고, 그 다음에 가변 경쇄의 3' 말단에 대한 역방 보체가
위치한다. AfeI와 BsiWI로 제한 효소 절단 시에, 이는 이출을 위한 인간 카파 경쇄 불변 영역과 인 프레임(in
frame)으로 인간 HAS 리더 서열을 이용하여 pGAPZ 벡터와 인-프레임으로 삽입을 가능하게 한다. (2) 중쇄에 대
하여 유사한 전략이 수행된다. 이용된 전방 프라이머는 AGCGCTTATTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC이다. AfeI 부위는
단일 밑줄로 표시된다. HSA 신호 서열의 끝은 이중 밑줄로 표시되고, 그 다음에 성숙 가변 중쇄에 대한 서열(밑
줄로 표시되지 않음)이 위치한다. 역방 중쇄 프라이머는 CTCGAGACGGTGACGAGGGT이다. XhoI 부위는 밑줄로 표시되
고, 그 다음에 가변 중쇄의 3' 말단에 대한 역방 보체가 존재한다. 이는 비교 지향성 클로닝 전략(comparable
directional cloning strategy)을 이용하여 pGAPZ 내에 앞서 삽입된 IgG-γ1 CH1-CH2-CH3 부위와 인-프레임으
로 중쇄의 클로닝을 가능하게 한다.
피치아 파스토리스(P. pastoris)의 반수체 ade1, ura3, met1과 lys3 숙주 균주 내로 발현 벡터의 형질전환. 반
수체 피치아 파스토리스(P. pastoris) 균주의 형질전환 및 피치아 파스토리스(P. pastoris) 유성 주기의 유전자
조작에 이용된 모든 방법은 Higgins, D. R., and Cregg, J. M., Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in
Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ에서 기술된다.
공개특허 10-2011-0112308
형질전환에 앞서, 각 발현 벡터는 피치아 파스토리스(P. pastoris) 게놈의 GAP 프로모터 좌위 내로 이들 벡터의
통합을 유도하기 위하여, GAP 프로모터 서열 내에서 AvrII로 선형화된다. 각 벡터의 시료는 이후, 전기천공
(electroporation)에 의해 ade1, ura3, met1과 lys3 균주의 전기적격성 배양액 내로 개별적으로 형질전환되고,
그리고 성공적인 형질전환체는 상기 항생제에 대한 그들의 내성에 의해 YPD Zeocin(플레오마이신) 평판 상에
서 선별되었다. 결과의 콜로니는 선별되고, YPD Zeocin(플레오마이신) 평판 상에서 단일 콜로니에 대하여 스
트리킹(streaking)되고, 이후 적절한 항체 유전자 삽입물에 대한 각 균주로부터 추출된 게놈 DNA 상에서 PCR 분
석에 의해 및/또는 콜로니 리프트/면역블롯 방법으로 항체 사슬을 합성하는 각 균주의 능력에 의해, 항체 유전
자 삽입물의 존재에 대하여 조사되었다(Wung et al. Biotechniques 21 808-812 (1996)). 3가지 중쇄 구조체 중
에서 한 가지를 발현하는 반수체 ade1, met1과 lys3 균주는 반수체 ura3 균주 발현 경쇄 유전자와 함께 2배체
작제를 위하여 수집된다. 이들 반수체 발현 중쇄 유전자는 2배체 분비 단백질을 생성시키기 위하여, 적절한 경
- 118 -