(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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이 시간과 대비하여 플롯팅된다.
피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현되고 정제된 이러한 인간화된 전장 비당화된 항체는 포유동물 발현된
단백질에 필적하는 특징을 나타낸다. 이에 더하여, 이러한 산물의 복수 투약은 재현가능한 반감기를 보이고, 이
는 이러한 생산 플랫폼이 강화된 면역원성을 나타내는 산물을 생성시키지 않는다는 것을 암시한다.
실시예 13 항체 단백질의 Octet 기계적 특성화
IL-6 신호전달은 IL-6 및 2가지 수용체: IL-6R1(CD126)과 gp130(IL-6 신호전달체) 사이에 상호작용에
의존한다. 항체의 작용 기전을 결정하기 위하여, Octet QK 기구(ForteBio; Menlo Park, CA)를 이용한 생물-층
간섭법(bio-layer interferometry)에 의해 기계적 연구가 수행되었다. 연구는 2가지 상이한 형태로 수행되었다.
첫 번째 방침에서, 비오틴화된 IL-6(R&D systems 부품 번호 206-IL-001MG/CF, 제조업체의 프로토콜에 따라
Pierce EZ-링크 설포-NHS-LC-LC-비오틴 제품 번호 21338을 이용하여 비오틴화됨)이 스트렙타비딘 코팅된 바이오
센서(ForteBio 제품 번호 18-5006)에 초기에 결합되었다. 결합은 신호에서 증가로서 모니터된다.
상기 센서에 결합된 IL-6은 이후, 문제되는 항체, 또는 희석 용액 단독과 함께 배양되었다. 상기 센서는 이후,
가용성 IL-6R1(R&D systems 제품 번호 227-SR-025/CF) 분자와 함께 배양되었다. IL-6R1 분자가 결합하지 못하
면, 상기 항체는 IL-6/IL-6R1 상호작용을 차단하는 것으로 간주되었다. 이들 복합체는 안정성 목적으로, IL-6R1
의 존재에서 gp130(R&D systems 228-GP-010/CF)과 함께 배양되었다. gp130이 결합하지 않으면, 상기 항체는
gp130과 IL-6의 상호작용을 차단하는 것으로 결론되었다.
두 번째 방침에서, 항체는 항-인간 IgG1 Fc-특이적 시약(ForteBio 부품 번호 18-5001)으로 코팅된 바이오센서에
결합되었다. IL-6이 상기 고정된 항체에 결합되고, 그리고 상기 센서가 IL-6R1과 함께 배양되었다. IL-6R1이
IL-6과 상호작용하지 않으면, 상기 IL-6 결합 항체는 IL-6/IL-6R1 상호작용을 차단하는 것으로 결론되었다. 항
체/IL-6/IL-6R1이 관찰되는 상황에서, 상기 복합체는 IL-6R1의 존재에서 gp130과 함께 배양되었다. gp130이 상
호작용하지 않으면, 상기 항체는 IL-6/gp130 상호작용을 차단하는 것으로 결론되었다. 모든 연구는 30℃와 1000
rpm에서, 200 ㎕ 최종 부피로 수행되었다. 이들 연구를 위하여, 모든 단백질은 ForteBio의 시료 희석 완충액(부
품 번호 18-5028)을 이용하여 희석되었다.
결과는 도 10(A-E)과 도 11에 제공된다.
실시예 14 펩티드 맵핑.
인간 IL-6 상에서 Ab1에 의해 인식되는 에피토프를 결정하기 위하여, 상기 항체가 웨스턴-블롯 기초된 분석에
이용되었다. 본 실시예에서 이용된 인간 IL-6의 형태는 183개 아미노산 길이의 서열(하기에 도시됨)을 보유하였
다. 이러한 서열을 포함하는 중복되는 15개 아미노산 펩티드의 57개-구성원 라이브러리가 상업적으로 합성되었
고 PepSpots 니트로셀룰로오스 막(JPT 펩티드 technologies, Berlin, Germany)에 공유 결합되었다. 중복되는
15개 아미노산 펩티드의 서열은 도 12에 도시되고 서열 번호: 590-646에 상응한다. 제조업체의 권고에 따라 블
롯(blot)이 준비되고 탐침되었다.
간단히 말하면, 블롯은 메탄올에서 미리 적셔지고, PBS에서 헹굼되고, 그리고 PBS/0.05% Tween에서 10% 탈지 우
유(차단 용액)에서 2시간 동안 차단되었다. Ab1 항체는 1 ㎎/㎖ 최종 희석도에서 이용되고, 그리고 HRP-접합된
생쥐 항-인간-카파 이차 항체(Southern BioTech #9220-05)는 1:5000 희석도에서 이용되었다. 항체 희석/배양은
차단 용액에서 수행되었다. 블롯은 Amersham ECL advance 시약(GE# RPN2135)을 이용하여 현색되고, 그리고 화학
발광 신호는 CCD 카메라(AlphaInnotec)를 이용하여 기록되었다. 이들 블롯의 결과는 도 13과 도 14에 도시된다.
펩티드 라이브러리를 생성시키는데 이용된 형태의 인간 IL-6 서열은 하기에 열거된다:
VPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQN
RFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM (서열 번호: 1).
실시예 15 Ab1은 IL-6에 대한 높은 친화성을 갖는다.
공개특허 10-2011-0112308
25℃에서, 쥐, 생쥐, 개, 인간, 그리고 필리핀 원숭이로부터 IL-6에 대한 Ab1의 결합 속도(Ka), 분리 속도(Kd)
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