(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

[0771]
[0772]
[0773]
[0774]
[0775]
[0776]
[0777]
[0778]
쇄 반수체 ura3과 교배된다.
단일 항체 사슬을 합성하는 반수체 균주의 교배 및 사합체 기능적 항체를 합성하는 2배체 유도체의 선별. 피치
아 파스토리스(P. pastoris) 반수체 균주를 교배하기 위하여, 교배되는 각각의 ade1(또는 met1 또는 lys3) 중쇄
생산 균주는 풍부한 YPD 평판을 교차하여 스트리킹되고, 그리고 ura3 경쇄 생산 균주는 두 번째 YPD 평판을 교
차하여 스트리킹된다(평판당 ~10개 스트리킹). 30℃에서 1일 또는 2일 배양후, 중쇄 균주를 포함하는 하나의 평
판 및 ura3 경쇄 균주를 포함하는 하나의 평판으로부터 세포는 각각의 중쇄 균주가 각 경쇄 균주와 혼합된 세포
의 패치를 포함하도록 하기 위하여, 교차 해치드 패턴(cross hatched pattern)으로 복제-도말 블록 상에서 무균
벨벳 천으로 이전되었다. 교차-스트리킹된 복제 도말된 세포는 이후, 교배 평판으로 이전되고 균주 간에 교배의
시작을 촉진하기 위하여 25℃에서 배양되었다. 2일후, 이들 교배 평판 상에서 세포는 복제-도말 블록 상에서 무
균 벨벳으로 다시 이전되고, 이후 최소 배지 평판으로 이전되었다. 이들 평판은 독립영양성 2배체 균주의 콜로
니의 선택성 성장을 가능하게 하기 위하여, 3일 동안 30℃에서 배양되었다. 발생된 콜로니는 정선되고, 그리고
콜로니 분리물을 선별하고 각각의 2배체 균주를 정제하기 위하여 두 번째 최소 배지 평판 상에 스트리킹된다.
결과의 2배체 세포주는 이후, 항체 생산에 대하여 조사된다.
추정 2배체 균주는 그들이 2배체이고 항체 생산을 위한 양쪽 발현 벡터를 포함한다는 것을 증명하기 위하여 시
험된다. 2배수성의 경우에, 균주의 시료는 이들 균주가 감수분열을 겪고 포자를 형성하도록 촉진하기 위하여 교
배 평판 상에 발라진다. 반수체 포자 산물은 수집되고 표현형에 대하여 조사된다. 결과의 포자 산물 중에서 유
의한 비율이 단일 또는 이중 영양요구체이면, 최초 균주는 2배체인 것으로 결론될 수 있다. 2배체 균주는 각각
으로부터 게놈 DNA를 추출하고 각 유전자에 특이적인 PCR 반응에 이러한 DNA를 이용함으로써 양쪽 항체 유전자
의 존재에 대하여 조사된다.
단일 항체 사슬을 합성하는 반수체 균주의 융합 및 사합체 기능적 항체를 합성하는 2배체 유도체의 선별. 앞서
기술된 교배 절차에 대한 대안으로, 단일-사슬 항체 생산 반수체 ade1과 ura3 균주의 개별 배양액은 스페로플라
스트화되고, 그들의 결과의 스페로플라스트는 폴리에틸렌 글리콜/CaCl2를 이용하여 융합된다. 융합된 반수체 균
주는 이후, 2배체 균주가 그들의 세포 벽을 재생시키고 가시적인 콜로니로 성장할 수 있도록 하기 위하여, 1 M
소르비톨과 최소 배지를 포함하는 아가에 끼워 넣어진다. 결과의 콜로니는 아가로부터 정선되고, 최소 배지 평
판 상에 스트리킹되고, 그리고 이들 평판은 2배체 세포주의 단일 세포로부터 콜로니를 생성시키기 위하여 30℃
에서 2일 동안 배양된다. 결과의 추정 2배체 세포주는 이후, 앞서 기술된 바와 같이 2배수성 및 항체 생산에 대
하여 조사된다.
항체의 정제와 분석. 전장 항체의 생산을 위한 2배체 균주는 앞서 기술된 방법을 이용하여 met1 경쇄와 lys3 중
쇄의 교배를 통하여 도출된다. 2배체 피치아 파스토리스(P. pastoris) 발현 균주의 진탕-플라스크 또는 발효기
배양액으로부터 배양액 배지는 수집되고, 그리고 SDS-PAGE 및 인간 IgG의 중쇄와 경쇄, 또는 특히, IgG의 중쇄
에 대한 항체를 이용한 면역블롯팅(immunoblotting)을 통해 항체 단백질의 존재에 대하여 조사된다.
효모 분비된 항체를 정제하기 위하여, 항체 생산 배양액으로부터 정화된 배지는 단백질 A 칼럼에 통과되고, 그
리고 20 mM 나트륨 인산염, pH 7.0, 결합 완충액으로 세척후, 단백질 A 결합된 단백질이 0.1 M 글리신 HCl 완충
액, pH 3.0을 이용하여 용출된다. 가장 많은 전체 단백질을 포함하는 분획물은 항체 단백질에 대하여 Coomasie
blue 염색된 SDS-PAGE 및 면역블롯팅에 의해 조사된다. 항체는 IL-6 인식을 위한 앞서 기술된 ELISA를 이용하여
특성화된다.
항체 활성의 분석. 재조합 효모-유래된 인간화된 항체는 앞서 기술된 IL-6 주동된 T1165 세포 증식 분석 및 IL-
6 촉진된 HepG2 합토글로빈 분석을 통하여 기능적 활성에 대하여 평가된다.
실시예 9 항-IL-6 항체 Ab1의 정맥내 투여에 의한 급성기 반응 중화
인간 IL-6은 쥐에서 급성기 반응을 유발할 수 있고, 그리고 쥐에서 자극되는 주요 급성기 단백질 중에서 한 가
지는 알파-2 마크로글로불린(A2M)이다. 상이한 용량(0.03, 0.1, 0.3, 1, 그리고 3 ㎎/㎏)의 항체 Ab1(n=10 쥐/
용량 수준) 또는 대조로서 다중클론 인간 IgG1(n=10마리 쥐)의 정맥내 투여후 1시간 시점에 제공된 100 ㎍의 인
간 IL-6의 단일 s.c. 주사에 대한 A2M 반응을 제거하는데 필요한 항체 Ab1의 용량을 평가하는 연구가 설계되었
다. 혈장은 회수되고, 그리고 A2M은 상업적 샌드위치 ELISA 키트(ICL Inc., Newberg OR; cat. no.- E-25A2M)를
통해 통해 정량되었다. 종점은 24시간 시점(post-Ab1)에서 A2M의 혈장 농도에서 차이이었다. 획득된 결과는 도
4에 제공된다.
- 119 -
공개특허 10-2011-0112308