(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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전사는 전사 활성자 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가될 수 있다. 이들 활성자는 DNA의 cis-작용 요소이고,
통상적으로 대략 10 내지 300개 bp를 보유하며, 프로모터에 작용하여 이의 전사를 증가시킨다. 전사 인핸서는
상대적으로 방향과 위치 독립적이고, 전사 단위에 대해 5'와 3'에서, 인트론 내에서, 그리고 코딩 서열 그 자체
내에서 관찰된다. 인핸서는 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터 내로 절단접합될 수 있지만, 바람
직하게는 프로모터로부터 5' 위치에 존재한다.
진핵 숙주 세포에 이용되는 발현 벡터는 또한, 전사의 종결 및 mRNA의 안정화를 위하여 필요한 서열을 포함할
수 있다. 이런 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비번역 부위 내에서, 번역 종결 코돈에 대해 3'로부
터 통상적으로 가용하다. 이들 부위는 mRNA의 비번역 부분 내에서, 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레
오티드 조각을 포함한다.
하나 이상의 전술한 성분을 포함하는 적절한 벡터의 작제는 표준 결찰 기술 또는 PCR/재조합 방법을 이용한다.
분리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 절단되고, 재단되고, 그리고 재조합 방법을 통해 필요한 플라스미드를 생성
시키기 위한 원하는 형태로 재-결찰된다. 작제된 플라스미드 내에서 정확한 서열을 확인하는 분석을 위하여, 숙
주 세포를 형질전환시키기 위한 결찰 혼합물이 이용되고, 그리고 성공적인 형질전환체가 적절한 경우에, 항생제
내성(가령, 암피실린 또는 Zeocin(플레오마이신))에 의해 선별된다. 형질전환체로부터 플라스미드가
제조되고, 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 분석되고 및/또는 서열화된다.
단편의 제한과 결찰에 대한 대안으로서, att 부위와 재조합 효소에 기초된 재조합 방법이 DNA 서열을 벡터 내로
삽입하는데 이용될 수 있다. 이런 방법은 예로써, Landy (1989) Ann.Rev.Biochem. 58:913-949에서 기술되고;
그리고 당업자에게 공지되어 있다. 이런 방법은 람다 및 대장균(E.coli)-인코딩된 재조합 단백질의 혼합물에 의
해 매개되는 분자간 DNA 재조합을 이용한다. 재조합은 상호작용 DNA 분자 상에서 특이적 부착(att) 부위 사이에
발생한다. att 부위의 설명을 위하여, Weisberg and Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage
Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed.(Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pp.211-250를 참
조한다. 이들 재조합 부위에 접하는 DNA 조각은 재조합후, att 부위가 각 모 벡터에 의해 제공된 서열로 구성되
는 하이브리드 서열이 되도록 치환된다. 재조합은 임의의 위상의 DNA 사이에 발생할 수 있다.
att 부위는 목적 서열을 적절한 벡터 내로 결찰하고; 특이적 프라이머의 이용을 통해 att B 부위를 포함하는
PCR 산물을 생성시키고; att 부위를 포함하는 적절한 벡터 내로 클로닝된 cDNA 라이브러리를 생성시키는 등으로
써 목적 서열 내로 도입될 수 있다.
본 명세서에서, 접힘은 폴리펩티드와 단백질의 3-차원 구조를 지칭하고, 여기서 아미노산 잔기 사이에 상호작용
은 상기 구조를 안정화시키는 기능을 한다. 비-공유 상호작용이 구조를 결정하는데 중요하긴 하지만, 통상적으
로 목적 단백질은 2개의 시스테인 잔기에 의해 형성된 분자내 및/또는 분자간 공유 이황화 결합을 보유할 것이
다. 자연 발생 단백질과 폴리펩티드 또는 이들의 유도체와 변이체의 경우에, 적절한 접힘은 전형적으로, 최적
생물학적 활성을 생성시키는 배열이고, 그리고 활성, 예를 들면, 리간드 결합, 효소 활성 등에 대한 분석으로
편의하게 모니터될 수 있다.
일부 경우에, 예를 들면, 원하는 산물이 합성 기원인 경우에, 생물학적 활성에 기초된 분석은 의미가 덜할 것이
다. 이런 분자의 적절한 접힘은 물리적 특성, 에너지 고려, 모델링 연구 등에 기초하여 결정될 수 있다.
발현 숙주는 접힘 및 이황화 결합 형성을 강화시키는 한 가지 이상의 효소, 다시 말하면, 폴다아제(foldase),
샤프로닌(chaperonin) 등을 인코딩하는 서열의 도입에 의해 더욱 변형될 수 있다. 이런 서열은 당분야에 공지된
벡터, 마커 등을 이용하여 효모 숙주 세포 내에서 구조성으로 또는 유도성으로 발현될 수 있다. 바람직하게는,
원하는 발현 패턴을 위하여 충분한 전사 조절 요소를 포함하는 이들 서열은 표적화된 방법을 통하여 효모 게놈
내로 안정적으로 통합된다.
가령, 진핵 PDI는 단백질 시스테인 산화와 이황화 결합 이성화의 효과적인 촉매일 뿐만 아니라, 샤프롱 활성을
보인다. PDI의 Co-발현은 다발성 이황화 결합을 보유하는 활성 단백질의 생산을 용이하게 할 수 있다. 또한,
BIP(면역글로불린 중쇄 결합 단백질); 시클로필린; 등의 발현이 목적된다. 본 발명의 한 구체예에서, 각각의 반
수체 모 균주는 별개의 접힘 효소를 발현한다, 가령 한 균주는 BIP를 발현하고, 그리고 다른 균주는 PDI 또는
이들의 조합을 발현한다.
공개특허 10-2011-0112308
용어 "원하는 단백질" 또는 "표적 단백질"은 동의어로서 이용되고, 일반적으로 본 명세서에서 기술된 인간화된
항체 또는 이의 결합 부분을 지칭한다. 용어 "항체"는 에피토프에 적합하고 이를 인식하는 특이적 형상을 갖는
임의의 폴리펩티드 사슬-포함 분자 구조를 포함하는 것으로 의도되고, 여기서 하나 이상의 비-공유 결합 상화작
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