(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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f. 하위-집단으로부터 B 세포를 분리하는 단계; 그리고
g. 단일 B 세포가 상기 항원에 특이적인 항체를 생산하는 지를 결정하는 단계.
전형적으로, 이들 방법은 원하는 항체를 인코딩하는 폴리펩티드와 핵산 서열을 전체적으로 또는 부분적으로, 분
리하고 염기서열분석하는 추가적인 단계를 추가로 포함할 것이다. 이들 서열, 또는 이들의 변형된 이형 또는 일
부분은 원하는 항원에 대한 재조합 항체를 생산하기 위하여 원하는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, B 세포의 클론 집단은 원하는 항원에 대한 항체를 생산하는 항체-분비 B 세포를 주로
포함하는 것으로 생각된다. 또한, 여러 항원, 그리고 상이한 B 세포 집단으로 획득된 실험 결과에 기초하여, 클
론성으로 생산된 B 세포 및 본 발명에 따라 생산된 이들로부터 유래된 분리된 항원-특이적 B 세포는 배양된 항
원-특이적 B 세포로부터 단일클론 항체를 도출하는 다른 방법과 비교하여, 전형적으로 상대적으로 높은 친화성
을 나타내고 게다가, 더욱 높은 에피토프 변이성의 단일클론 항체의 선별체를 효과적으로 및 재현적으로 생산할
수 있는 단일클론 항체를 분비하는 것으로 생각된다. 예시적인 구체예에서, 이런 B 세포 선별 방법에 이용되는
면역 세포의 집단은 토끼로부터 유래될 것이다. 하지만, 비-인간과 인간 숙주를 비롯하여, 항체를 생산하는 다
른 숙주가 면역 B 세포의 공급원으로서 대안으로 이용될 수 있다. B 세포의 공급원으로서 토끼의 이용은 이들
방법에 의해 도출될 수 있는 단일클론 항체의 다양성을 강화시키는 것으로 생각된다. 또한, 본 발명에 따라 토
끼로부터 유래된 항체 서열은 전형적으로, 인간 항체 서열에 높은 서열 동일성을 갖는 서열을 보유하고, 따라서
항원성을 거의 나타내지 않기 때문에 인간에 이용하기 적합하다. 인간화의 과정에서, 최종 인간화 항체는 일반
적으로 이식에 이용되는 인간 표적 서열과 대비하여 성질이 극히 상이한 숙주 CDR 잔기의 부분집합에 한정되는
더욱 적은 외래/숙주 잔기 함량을 갖는다. 이는 인간화된 항체 단백질에서 완전한 활성 회복의 가능성을 증진시
킨다.
본 명세서에 기술된 농축 단계를 이용한 항체 선별의 방법은 면역화된 숙주로부터 면역 세포-포함 세포 집단을
획득하는 단계를 포함한다. 면역화된 숙주로부터 면역 세포-포함 세포 집단을 획득하는 방법은 당분야에 공지되
어 있고, 그리고 일반적으로, 숙주에서 면역 반응을 유도하는 단계 및 숙주로부터 세포를 수확하여 하나 이상의
세포 집단을 획득하는 단계를 포함한다. 상기 반응은 원하는 항원에 대하여 숙주를 면역화함으로서 유도될 수
있다. 대안으로, 이런 면역 세포의 공급원으로서 이용되는 숙주는 원하는 항원, 예를 들면, 특정 병원균, 예를
들면, 세균 또는 바이러스로 감염되거나, 또는 대안으로 개체를 괴롭히는 암에 대한 특이적 항체 반응을 적재하
는 개체에 자연적으로 노출될 수 있다.
숙주 동물은 당분야에 널리 공지되어 있고, 여기에는 기니 피그, 토끼, 생쥐, 쥐, 비-인간 영장류, 인간, 그리
고 다른 포유동물과 설치류, 닭, 소, 돼지, 염소, 그리고 양이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 바람직하게
는, 숙주는 포유동물, 더욱 바람직하게는, 토끼, 생쥐, 쥐, 또는 인간이다. 항원에 노출될 때, 숙주는 상기 항
원에 대한 본래의 면역 반응의 일부로서 항체를 생산한다. 앞서 언급된 바와 같이, 면역 반응은 질환의 결과로
서 자연적으로 발생하거나, 또는 항원으로 면역화에 의해 유도될 수 있다. 면역화는 당분야에 공지된 임의의 방
법, 예를 들면, 면역 반응을 강화시키는 작용제, 예를 들면, 완전 또는 불완전 Freund 어쥬번트와 함께 또는 이
러한 어쥬번트 없이, 항원의 1회 이상 주입에 의해 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에서는 또한, 비
장내(intrasplenic) 면역화를 고려한다. 숙주 동물의 생체내 면역화의 대안으로서, 상기 방법은 숙주 세포 배양
액을 시험관내에서 면역화시키는 단계를 포함할 수 있다.
면역 반응(가령, 혈청 항체 검출에 의해 측정됨)을 위한 충분한 시간 이후에, 숙주 동물 세포는 하나 이상의 세
포 집단을 획득하기 위하여 수확된다. 바람직한 구체예에서, 수확된 세포 집단은 항체 결합 강도 및/또는 항체
기능성에 대하여 스크리닝된다. 수확된 세포 집단은 바람직하게는, 비장, 림프절, 골수, 및/또는 말초혈 단핵
세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 중에서 적어도 하나로부터 유래된다. 이들 세포는 한 가지 이
상의 공급원으로부터 수확되고 집합될 수 있다. 일정한 항원의 경우에 일정한 공급원이 바람직할 수 있다.
가령, IL-6의 경우에 비장, 림프절, 그리고 PBMC가 바람직하다; 그리고 TNF의 경우에 림프절이 바람직하다. 세
포 집단은 면역화 이후, 대략 20일 내지 대략 90일 또는 그 내에 증분, 바람직하게는 대략 50일 내지 대략 60일
시점에 수확된다. 수확된 세포 집단 및/또는 이로부터 단일 세포 현탁액은 항체 선별을 위하여 농축되고, 스크
리닝되고, 및/또는 배양될 수 있다. 수확된 세포 집단 내에서 항원-특이적 세포의 빈도는 일반적으로, 대략 1%
내지 대략 5%, 또는 그 내에 증분이다.
공개특허 10-2011-0112308
한 구체예에서, 수확된 세포 집단으로부터 단일 세포 현탁액은 바람직하게는, Miltenyi 비드를 이용함으로써 농
축된다. 대략 1% 내지 대략 5%의 항원-특이적 세포의 빈도를 갖는 수확된 세포 집단으로부터, 100%에 근접하는
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