In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

dragon.ivf.com

In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

3.2.3. Waschmedium für Spermatozoen

Einen Tag vor Gebrauch wurde physiologische Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) mit 0,1 %

BSA (,Bovines Serum Albumin Fraction V, Sigma, Deisenhofen, # A-9647) und 70

µg/ml Kanamycin (Sigma, Deisenhofen) supplementiert. Der pH-Wert der

Waschlösung wurde mit 0,01M HCl auf 7,2 eingestellt. Das Medium wurde mit 0,2 µm

Filtropur S - Filtern (Sarstedt, Nümbrecht) steril filtriert und in lichtundurchlässigen

sterilen 100ml Glasflaschen mit Stopfen und Parafilm (GLW, Würzburg) bis zum

Gebrauch bei 5-8°C im Kühlschrank aufbewahrt.

3.2.4. Kapazitationsmedium

50ml TCM199 mit L-Glutamin (Sigma, Deisenhofen, # M-5017) wurde mit 70µg/ml

Kanamycin (Sigma, Deisenhofen), 2,92 mM Calciumlaktat (Sigma, Deisenhofen), 0,91

mM Natriumpyruvat (Sigma, Deisenhofen) und 3,05 mM D-Glucose (Sigma,

Deisenhofen) angereichert. Als Serumkomponente wurde Hitze-inaktiviertes FKS

(Fetales Kälberserum, Gibco BRL, Eggenstein) eingesetzt. Das Medium wurde mit 0,2

µm Filtropur S - Filtern (Sarstedt, Nümbrecht) steril filtriert und in

lichtundurchlässigen sterilen 100ml Glasflaschen mit Stopfen und Parafilm bis zum

Gebrauch bei 5-8°C im Kühlschrank aufbewahrt.

3.2.5. Befruchtungsmedium

Das Befruchtungsmedium entsprach bis auf den Zusatz von 2,01mM Caffein (Sigma,

Deisenhofen) dem Kapazitationsmedium. Caffein wurde erst 40 Minuten vor Gebrauch

des Mediums hinzugefügt. Das Medium wurde mit 0,2 µm Filtropur S-Filtern

(Sarstedt, Nümbrecht) steril filtriert.

30 Minuten vor Insemination der Oozyten wurde das Befruchtungsmedium mit Caffein

im Brutschrank bei 5% CO2, 39°C und 100% Luftfeuchte äquilibriert, nachdem es

bereits ohne Caffein über Nacht im Brutschrank aufbewahrt worden war.

3.2.6. Medien der frühen Embryokultur

Es wurde ein modifiziertes Krebs-Ringer-Medium (North Carolina South United,

NCSU-23)- für die In-vitro-Kultivierung in vitro fertilisierter Schweineembryonen

36

Weitere Magazine dieses Users
Ähnliche Magazine