In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

3.2.3. Waschmedium für Spermatozoen
Einen Tag vor Gebrauch wurde physiologische Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) mit 0,1 %
BSA (,Bovines Serum Albumin Fraction V, Sigma, Deisenhofen, # A-9647) und 70
µg/ml Kanamycin (Sigma, Deisenhofen) supplementiert. Der pH-Wert der
Waschlösung wurde mit 0,01M HCl auf 7,2 eingestellt. Das Medium wurde mit 0,2 µm
Filtropur S - Filtern (Sarstedt, Nümbrecht) steril filtriert und in lichtundurchlässigen
sterilen 100ml Glasflaschen mit Stopfen und Parafilm (GLW, Würzburg) bis zum
Gebrauch bei 5-8°C im Kühlschrank aufbewahrt.
3.2.4. Kapazitationsmedium
50ml TCM199 mit L-Glutamin (Sigma, Deisenhofen, # M-5017) wurde mit 70µg/ml
Kanamycin (Sigma, Deisenhofen), 2,92 mM Calciumlaktat (Sigma, Deisenhofen), 0,91
mM Natriumpyruvat (Sigma, Deisenhofen) und 3,05 mM D-Glucose (Sigma,
Deisenhofen) angereichert. Als Serumkomponente wurde Hitze-inaktiviertes FKS
(Fetales Kälberserum, Gibco BRL, Eggenstein) eingesetzt. Das Medium wurde mit 0,2
µm Filtropur S - Filtern (Sarstedt, Nümbrecht) steril filtriert und in
lichtundurchlässigen sterilen 100ml Glasflaschen mit Stopfen und Parafilm bis zum
Gebrauch bei 5-8°C im Kühlschrank aufbewahrt.
3.2.5. Befruchtungsmedium
Das Befruchtungsmedium entsprach bis auf den Zusatz von 2,01mM Caffein (Sigma,
Deisenhofen) dem Kapazitationsmedium. Caffein wurde erst 40 Minuten vor Gebrauch
des Mediums hinzugefügt. Das Medium wurde mit 0,2 µm Filtropur S-Filtern
(Sarstedt, Nümbrecht) steril filtriert.
30 Minuten vor Insemination der Oozyten wurde das Befruchtungsmedium mit Caffein
im Brutschrank bei 5% CO2, 39°C und 100% Luftfeuchte äquilibriert, nachdem es
bereits ohne Caffein über Nacht im Brutschrank aufbewahrt worden war.
3.2.6. Medien der frühen Embryokultur
Es wurde ein modifiziertes Krebs-Ringer-Medium (North Carolina South United,
NCSU-23)- für die In-vitro-Kultivierung in vitro fertilisierter Schweineembryonen
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