In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF
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fusselfreien Tuch getrocknet und bis zur Verwendung in einer Objektträgerbox<br />
gelagert.<br />
Die in <strong>vitro</strong> gereiften und expandierten <strong>Oozyten</strong> wurden für 30 Sekunden in 50µl PBS<br />
+2%FKS + 80I.E Hyaluronidase-Drops (# H-2251 aus Schafhoden, Sigma,<br />
Deisenhofen) inkubiert und die anhaftenden Kumulusmassen mit einer<br />
Mikropasteurpipette entfernt. Bei besonders fest anhaftenden Zellen, insbeondere der<br />
Corona radiata, wurden die <strong>Oozyten</strong> in 1ml 2% FKS-haltigem PBS-Medium mit 80I.E.<br />
Hyaluronidase für 3 Minuten im Reagenzglas geschüttelt (Mixomat, Hersel, Bonn).<br />
Die Darstellung der Metaphase II geschah nach der Tarkowski-Methode<br />
(TARKOWSKI, 1966). Dazu wurden die <strong>Oozyten</strong> in 2ml 39°C warmer, hypotoner<br />
1,1%iger Natriumcitratlösung für 5 Minuten inkubiert. Danach wurden sie zentral <strong>auf</strong><br />
dem Objektträger so plaziert, daß sie nur noch mit wenig hypotonem Natriumcitrat<br />
benetzt waren, allerdings ohne auszutrocknen.<br />
Das Auftropfen von 50µl eiskalter Eisessig/Alkohollösung (1:3, v:v) <strong>auf</strong> die <strong>Oozyten</strong><br />
brach das Zytoplasma der <strong>Oozyten</strong> <strong>auf</strong> und schwemmte die Chromosomen aus. Nach<br />
Trocknung <strong>auf</strong> der Wärmepatte wurden die Objektträger mit den Chromosomen für 5-<br />
6 Minuten in frischer 2%iger Giemsalösung gefärbt, mit Aqua Dest gespült und erneut<br />
getrocknet. Anschließend wurden die Präparate mit einem Tropfen Eindeckmedium<br />
(DPX, Gurr, BDH, England) und Deckgläschen fixiert.<br />
Die Chromosomenuntersuchung fand <strong>auf</strong> einem Phasenkontrastmikroskop (Axioskop<br />
Zeiss, Göttingen) bei 400facher Vergrößerung statt.<br />
3.7. Einfluß von Anti-h<strong>In</strong>hibinα Ziegenserum (Versuch 2)<br />
<strong>In</strong> einem zweiten Versuch sollte der Einfluß eines Ziegenserums, das Antikörper gegen<br />
<strong>In</strong>hibin (Anti-h<strong>In</strong>hibinα Ziegenserum) enthielt, untersucht werden (Tabelle 3.).<br />
<strong>In</strong> diesem Versuch wurden von 1872 mit Giemsa angefärbten <strong>Oozyten</strong> (Abb. 2) 1430<br />
wiedergefunden und deren Chromosomenkonstellation beurteilt (Tabelle 9). Das<br />
entspricht einer Wiederfindungsrate von 76%. Der Versuch wurde neunmal<br />
wiederholt.<br />
Das verwendete „Anti-<strong>In</strong>hibin“ wurde von immunisierten Ziegen gewonnen und lag<br />
somit als Bestandteil von Ziegenserum vor, welches nicht hitzeinaktiviert wurde, um<br />
so einer eventuellen Zerstörung der Antikörper vorzubeugen (Anti-INH). Dieses<br />
antikörperhaltige Serum wurde einem hitzeinaktivierten östrischen antikörperfreiem<br />
Ziegenserum (ZS) in den Konzentrationen von 0,1 und 1% zugesetzt, so daß die<br />
Proteinquelle im Medium in der Summe 10% ergab. Als Kontrolle diente Ziegenserum<br />
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