In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

FKS im Zentrifugenröhrchen überführt, um das Enzym Trypsin zu inaktivieren. Nach

10 minütiger Zentrifugation bei 1500 x g wurde das Eileitersediment mit

Einfriermedium (DMEM + 10%FKS + 10%DMSO + 1ml Penicillin-Streptomycin-

Lösung + 0,5ml 20%ige Glucoselösung) aufgenommen, portioniert und im

Kryoröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) bei -196°C im flüssigen Stickstoff bis zur

Verwendung tiefgefroren.

3.9.1.1. Herstellung der Eileiter - Feederlayer

Die tiefgefrorenen Eileiterzellen (vgl Kap. 3.9.1.) wurden bei 37°C im Wasserbad

aufgetaut und in 10ml Zellwaschmedium (TCM199 + 70µg/ml Kanamycin + 20% FKS)

überführt. Nach einer Zentrifugation bei 1500 x g für 10 Minuten wurde der Überstand

verworfen, und das Zellsediment erneut in 500µl Zellwaschmedium aufgenommen und

resuspendiert. Diese Eileiterzellsuspension wurde nun zu 10x10 6 Zellen/ml in einer

Vierlochschale in 500µl Eileitermedium ausgesäht und bis zum Gebrauch für drei Tage

im Brutschrank bei 39°C und 5% CO2 inkubiert. Nach Erhalt des konfluenten

Monolayers wurde das Medium abgenommen, ohne die Zellage zu verletzten und mit

dem bei 39°C und 5% CO2 äquilibrierten Medium des jeweiligen Versuchansatzes auf

der 37°C warmen Wärmeplatte stehend für eine Minute überschichtet. Nach

Entfernung dieses Mediums wurde erneut frisches Medium des einzelnen

Versuchsansatztes ersetzt, um ein definiertes Mediummilieu innerhalb eines Wells zu

gewährleisten.

3.9.2. Herstellung der Buffalo-Rat-Liver-Feederlayer

Die BRL-Zellinie (Buffalo-Red-Liver) aus dem Institut für Institut für

Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersleben lag tiefgefroren im

flüssigen Stickstoff vor. Sie wurde wie tiefgefrorene Eileiterzellen aufbereitet und

ausgesäht. Die Zelldichte in der Vierlochschale betrug 1x10 6 BRL-Zellen/ml.

3.10. Einsatz von Eileiter- und Buffalo-Rat-Liver-Feederlayern (Versuch 4)

Aus den vorhergehenden Untersuchungen ergab sich die Frage, ob der Zusatz von

nicht hitzeinaktiviertem Ziegenserum oder anti - inhibinhaltigem Ziegenserum einen

Einfluß auf die nukleare und zytoplasmatische In-vitro-Maturation der Oozyten hat,

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