In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

FKS im Zentrifugenröhrchen überführt, um das Enzym Trypsin zu inaktivieren. Nach
10 minütiger Zentrifugation bei 1500 x g wurde das Eileitersediment mit
Einfriermedium (DMEM + 10%FKS + 10%DMSO + 1ml Penicillin-Streptomycin-
Lösung + 0,5ml 20%ige Glucoselösung) aufgenommen, portioniert und im
Kryoröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) bei -196°C im flüssigen Stickstoff bis zur
Verwendung tiefgefroren.
3.9.1.1. Herstellung der Eileiter - Feederlayer
Die tiefgefrorenen Eileiterzellen (vgl Kap. 3.9.1.) wurden bei 37°C im Wasserbad
aufgetaut und in 10ml Zellwaschmedium (TCM199 + 70µg/ml Kanamycin + 20% FKS)
überführt. Nach einer Zentrifugation bei 1500 x g für 10 Minuten wurde der Überstand
verworfen, und das Zellsediment erneut in 500µl Zellwaschmedium aufgenommen und
resuspendiert. Diese Eileiterzellsuspension wurde nun zu 10x10 6 Zellen/ml in einer
Vierlochschale in 500µl Eileitermedium ausgesäht und bis zum Gebrauch für drei Tage
im Brutschrank bei 39°C und 5% CO2 inkubiert. Nach Erhalt des konfluenten
Monolayers wurde das Medium abgenommen, ohne die Zellage zu verletzten und mit
dem bei 39°C und 5% CO2 äquilibrierten Medium des jeweiligen Versuchansatzes auf
der 37°C warmen Wärmeplatte stehend für eine Minute überschichtet. Nach
Entfernung dieses Mediums wurde erneut frisches Medium des einzelnen
Versuchsansatztes ersetzt, um ein definiertes Mediummilieu innerhalb eines Wells zu
gewährleisten.
3.9.2. Herstellung der Buffalo-Rat-Liver-Feederlayer
Die BRL-Zellinie (Buffalo-Red-Liver) aus dem Institut für Institut für
Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersleben lag tiefgefroren im
flüssigen Stickstoff vor. Sie wurde wie tiefgefrorene Eileiterzellen aufbereitet und
ausgesäht. Die Zelldichte in der Vierlochschale betrug 1x10 6 BRL-Zellen/ml.
3.10. Einsatz von Eileiter- und Buffalo-Rat-Liver-Feederlayern (Versuch 4)
Aus den vorhergehenden Untersuchungen ergab sich die Frage, ob der Zusatz von
nicht hitzeinaktiviertem Ziegenserum oder anti - inhibinhaltigem Ziegenserum einen
Einfluß auf die nukleare und zytoplasmatische In-vitro-Maturation der Oozyten hat,
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