In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

3.9. Herstellung von Feederlayern
3.9.1. Gewinnung der Eileiterzellen für die Feederlayerkultur
Die Eileiter wurden von peripuberalen Jungsauen auf dem Schlachthof gewonnen.
Beide Tuben wurden cranial am Ostium abdominale tubae uterinae und distal des
Isthmus tubae uterinae am Uterushorneingang mit einem Kunststoffaden (Synthacord
EP 7, Beyverts, Berlin) fest verschlossen, bevor sie mit einer Schere vom Uterus
abgetrennt wurden. Sie wurden danach sofort in 1000ml eiskalter 0,9%iger NaCl-
Lösung mit 10ml Penicillin/Streptomycin Lösung (= 200I.E./ml Penicillin; 200µg/ml
Streptomycin, Gibco BRL, Eggenstein) gesammelt und ins Labor transportiert. Alle
weiteren Arbeitsschritte zur Präparation der Eileiter erfolgten unter sterilen
Bedingungen mittels der Reinraumwerkbank (Steag, Rettberg, Göttingen). Nach
zweimaligem Waschen der Organe in eiskalter 0,9%iger NaCl-Lösung mit 10ml
Penicillin/Streptomycin Lösung (=200I.E./ml Penicillin; 200µg/ml Streptomycin, Gibco
BRL, Eggenstein) wurde jeweils ein Eileiter für 15 Sekunden in 70%igem Alkohol
gespült. Danach erfolgte erneut eine sorgfältige Spülung in eiskalter physiologischer
Kochsalzlösung ohne Antibiotika. Jetzt wurde am abgebundenen Isthmus tubae
uterinae das Lumen der Ampulla tubae uterinae eröffnet. Diese Öffnung wurde über
ein offenes Zentrifugenröhrchen geführt, um dann auch den oberen Abbindefaden am
Ostium abdominale tubae uterinae zu entfernen. Nun war es möglich, mit einer
stumpfen Kanüle 10ml Eileiterspülmedium (TCM199 + 70 µg/ml Kanamycin + 20%
FKS) durch den Eileiter zu pressen. Das im Zentrifugenröhrchen aufgefangene
Medium mit Eileiterzellen wurde mit Deckel bis zur weiteren Aufbereitung auf Eis
gelagert.
Waren alle Eileiter gespült, wurde eine Zentrifugation der im Medium angereicherten
Oviduktzellen bei 1500 x g für 10min durchgeführt. Der Überstand des Mediums
wurde verworfen und durch 500µl frisches Eileiterspülmedium ersetzt. Das Sediment
wurde resuspendiert und in 10ml 39°C warmes und bei 5% CO2 äquilibriertes
Eileitermedium in 100mm Zellkulturschalen ausgesäht. Die Eileiterepithelzellkultur
war nach einer Woche konfluent und wurde nach Trypsinisierung noch zweimal neu
passagiert. Nach der letzten Pasage wurden die Eileiterzellen mit PBS (ohne Calciumund
Antibiotika) gewaschen, um das FKS aus dem Eileitermedium zu entfernen.
Danach wurden die konfluenten Eileiterfeeder mit 0,5% Trypsin-EDTA für 5 Minuten
auf der Wärmeplatte inkubiert. Die nach der Inkubationszeit abgelösten Eileiterzellen
wurden nun mit einer Pasteurpipette aufgenommen und in 10ml Eileitermedium mit
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