In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

3.9. Herstellung von Feederlayern

3.9.1. Gewinnung der Eileiterzellen für die Feederlayerkultur

Die Eileiter wurden von peripuberalen Jungsauen auf dem Schlachthof gewonnen.

Beide Tuben wurden cranial am Ostium abdominale tubae uterinae und distal des

Isthmus tubae uterinae am Uterushorneingang mit einem Kunststoffaden (Synthacord

EP 7, Beyverts, Berlin) fest verschlossen, bevor sie mit einer Schere vom Uterus

abgetrennt wurden. Sie wurden danach sofort in 1000ml eiskalter 0,9%iger NaCl-

Lösung mit 10ml Penicillin/Streptomycin Lösung (= 200I.E./ml Penicillin; 200µg/ml

Streptomycin, Gibco BRL, Eggenstein) gesammelt und ins Labor transportiert. Alle

weiteren Arbeitsschritte zur Präparation der Eileiter erfolgten unter sterilen

Bedingungen mittels der Reinraumwerkbank (Steag, Rettberg, Göttingen). Nach

zweimaligem Waschen der Organe in eiskalter 0,9%iger NaCl-Lösung mit 10ml

Penicillin/Streptomycin Lösung (=200I.E./ml Penicillin; 200µg/ml Streptomycin, Gibco

BRL, Eggenstein) wurde jeweils ein Eileiter für 15 Sekunden in 70%igem Alkohol

gespült. Danach erfolgte erneut eine sorgfältige Spülung in eiskalter physiologischer

Kochsalzlösung ohne Antibiotika. Jetzt wurde am abgebundenen Isthmus tubae

uterinae das Lumen der Ampulla tubae uterinae eröffnet. Diese Öffnung wurde über

ein offenes Zentrifugenröhrchen geführt, um dann auch den oberen Abbindefaden am

Ostium abdominale tubae uterinae zu entfernen. Nun war es möglich, mit einer

stumpfen Kanüle 10ml Eileiterspülmedium (TCM199 + 70 µg/ml Kanamycin + 20%

FKS) durch den Eileiter zu pressen. Das im Zentrifugenröhrchen aufgefangene

Medium mit Eileiterzellen wurde mit Deckel bis zur weiteren Aufbereitung auf Eis

gelagert.

Waren alle Eileiter gespült, wurde eine Zentrifugation der im Medium angereicherten

Oviduktzellen bei 1500 x g für 10min durchgeführt. Der Überstand des Mediums

wurde verworfen und durch 500µl frisches Eileiterspülmedium ersetzt. Das Sediment

wurde resuspendiert und in 10ml 39°C warmes und bei 5% CO2 äquilibriertes

Eileitermedium in 100mm Zellkulturschalen ausgesäht. Die Eileiterepithelzellkultur

war nach einer Woche konfluent und wurde nach Trypsinisierung noch zweimal neu

passagiert. Nach der letzten Pasage wurden die Eileiterzellen mit PBS (ohne Calciumund

Antibiotika) gewaschen, um das FKS aus dem Eileitermedium zu entfernen.

Danach wurden die konfluenten Eileiterfeeder mit 0,5% Trypsin-EDTA für 5 Minuten

auf der Wärmeplatte inkubiert. Die nach der Inkubationszeit abgelösten Eileiterzellen

wurden nun mit einer Pasteurpipette aufgenommen und in 10ml Eileitermedium mit

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