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Abschlussbericht AiF-FV 13733N
2 Analytik
Für die Durchführung des Forschungsvorhabens war es essentiell, zunächst eine standardisierte
Methode zur Bestimmung der einzelnen CMP-Fraktionen simultan mit den majoren
Molkenproteinen zu etablieren. Zudem war es erforderlich die Einflüsse der Prozesse und
Milieubedingungen auf die Glykosylierung des CMP zu bestimmen. Da Sialinsäure der dominante
Zuckerrest am GMP ist und zudem für die biologische Funktionalität von CMP eine
bedeutende Rolle spielt, wurde zu diesem Zwecke eine Methode zur Bestimmung der am
GMP gebundenen Sialinsäure erarbeitet.
2.1 Bestimmung der CMP-Fraktionen mittels RP-HPLC
Zur analytischen Bestimmung von CMP werden in der Literatur verschiedene Reversed-
Phase High-Performance-Liquid-Chromatography(RP-HPLC)-Methoden beschrieben. Die
meisten Methoden dienen dem Nachweis von Labmolkepulver in Milch- oder Buttermilchpul-
ver (Ferreira & Oliveira, 2003, 1989) sowie der Verfolgung der κ-Caseinhydrolyse während
dem Labprozess (Calvo, 2002, Reid et al., 1997, Coolbear et al., 1996, Sharma et al., 1993).
Bei diesen Methoden wird jedoch lediglich das nicht-glykosylierte CMP der genetischen Variante
A als einzelner Peak oder die Gesamtheit aller CMP-Fraktionen in mehreren, nicht von
einander getrennten Peaks analysiert. Ein weiterer Nachteil dieser Methoden ist, dass diese
mittels Trichloressigsäure (TCA) die Proben vorbehandeln, um die Molkenproteine und restlichen
Caseine auszufällen. Bereits van Hooydonk et al. (1984) stellten fest, dass durch eine
TCA-Endkonzentration > 2 % bereits CMP an Löslichkeit verliert. Jedoch findet bei den meisten
Methoden eine Endkonzentration von 8 % TCA Anwendung (Sharma et al., 1993, Leonil
& Molle, 1991, Olieman & Vanriel, 1989), da erst bei dieser TCA-Konzentration alle Molkenproteine
präzipitieren. Die simultane Analyse von CMP und Molkenproteinen, wie bei Elgar et
al. (2000) und Leonil et al. (1997) beschrieben, resultiert in nicht klar von einander getrennten
Peaks der nicht-glykosylierten und glykosylierten Fraktionen des CMP sowie der genetischen
Varianten von β-Lactoglobulin (β-Lg).
Aus diesem Grund wurde bereits in dem Vorprojekt FEI-Forschungsfond-Vorhaben FF-05 zu
diesem Forschungsvorhaben eine RP-HPLC-Methode zur Analyse von CMP etabliert, die
sich dadurch auszeichnet, dass sie das CMP in seiner Gesamtheit erfassen kann. Bei dieser
Methode wird bei der Probenvorbereitung weder die Zusammensetzung noch die zu analysierende
Menge verändert sowie auf die Fällung mittels TCA verzichtet. Somit ermöglicht
diese Methode, das CMP sowohl quantitativ als auch qualitativ zu erfassen. Ziel im Rahmen
dieses Forschungsvorhabens war es, die Methode dahingehend weiterzuentwickeln, dass
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