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Abschlussbericht AiF-FV 13733N<br />
Daher war es Ziel, Einflüsse der Prozess- und Milieubedingungen auf den Gehalt an CMPgebundener<br />
Sialinsäure bestimmen zu können.<br />
Zunächst ergab sich folgende Problemstellung: Die in der Literatur beschriebenen photometrischen<br />
Methoden zur Bestimmung von Sialinsäure (Schauer & Corfield, 1982) eignen sich<br />
entweder zur Bestimmung der gesamten Sialinsäure ohne Differenzierung hinsichtlich gebundener<br />
bzw. freier Sialinsäure (Reuter & Schauer, 1994, Schauer, 1978, Jourdian et al.,<br />
1971, Böhm et al., 1954), oder lediglich zur Bestimmung von frei vorliegender Sialinsäure<br />
(Nakano & Ozimek, 1999, Marier et al., 1963, Warren, 1959). Die gebundene Sialinsäure<br />
kann nur aus der Differenz der ermittelten Werte für gesamte und freie Sialinsäure berechnet<br />
werden, jedoch führt die Verrechnung von Werten, die aus zwei unterschiedlichen Methoden<br />
ermittelt werden zu erheblichen Ungenauigkeiten. Daher stellte sich die Frage, wie mittels<br />
ein und derselben Methode zwischen gebundener und freien Sialinsäure mit hoher Genauigkeit<br />
unterschieden werden kann.<br />
Nach eingehender Literaturstudie wurde die Sialinsäurebestimmung mittels Bialsreagenz am<br />
Institut etabliert, da sie sich durch eine hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit auszeichnet<br />
(Reuter & Schauer, 1994). Diese Methode erlaubt jedoch herkömmlich lediglich die Bestimmung<br />
des gesamten Sialinsäuregehaltes in einer Probe. Um zwischen gebundener und freier<br />
Sialinsäure unterscheiden zu können, wurde die Bials-Methode dahingehend modifiziert,<br />
dass in der Probenvorbereitung die freie und gebundene Sialinsäure mittels Membranzentri-<br />
fugation (Macrosep ® MWCO 10K, Pall) voneinander getrennt werden.<br />
2.2.1 Material und Methoden<br />
CMP<br />
CMP wurde wie in Kapitel 2.1.1 beschrieben hergestellt und analysiert.<br />
Für die Stammlösung wurden 0,3 % CMP in bi-destilliertem Wasser gelöst und über Nacht<br />
bei 4 °C quellen gelassen.<br />
Sialinsäurestandard<br />
N-Acetylneuraminic acid C11H19O9, synthetisch, > 98 %, Fluka, Buchs<br />
Für die Stammlösung wurden 0,04 % Sialinsäure in bi-destilliertem Wasser gelöst und bei<br />
-18 °C gelagert.<br />
Bialsreagenz<br />
5-Methylresorcin C7H8O2, 97 %, Sigma-Aldrich, Taufkirchen<br />
Eisen(III)-chlorid-Hexahydrat FeCl3·6H2O, 97%, Sigma-Aldrich, Taufkirchen<br />
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