THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
cellules ont été marquées avec un agent intercalant de l’ADN : le 4,6-diamidino-2-
phenylindole (DAPI) et observées sous UV (longueurs d’ondes d’excitation : 365 nm,
d’émission : 397 nm). Pour une observation directe, une goutte de culture (10 µL) est
mélangée à 2 µL de DAPI (20 µg. mL -1 ) sur du parafilm, puis déposée entre lame et lamelle,
et observée en épifluorescence.
Cependant, les cellules de Thoma ne sont pas utilisables en épifluorescence. La
méthode utilisée pour le dénombrement cellulaire consiste à réaliser des filtres comme suit :
- coloration de filtres blancs (porosité 0,22 µm, Nucléopore ® - Costar) au Noir d’Irgalan
pendant au moins une nuit par immersion, rinçage à l’eau distillée avant utilisation,
- marquage des cellules : 200 µL de culture (éventuellement diluée) + 200 µL de DAPI (20
µg. mL -1 ) + 1,6 mL d’eau MilliQ stérile (volume total = 2 mL).
- la solution est filtrée sur le filtre Nucléopore teinté (face brillante au-dessus) à l’aide d’une
tulipe de filtration et d’une pompe à vide,
- le filtre est ensuite séché, placé sur lame, recouvert d’huile à immersion pour
épifluorescence (Olympus), puis recouvert d’une lamelle avant observation en microscopie à
épifluorescence.
Le microscope est équipé d’une caméra vidéo et d’un écran qui facilitent le
comptage. Les cellules sont comptées sur l’écran. La concentration cellulaire de l’échantillon
de culture initial (C) est calculée à partir du nombre de cellules par écran (N), du nombre
d’écrans couvrant la surface totale du filtre (G), de la dilution de la culture (d). Pour 1 mL de
filtrat, le nombre de cellules par mL est : C = N x G x d.
La cytométrie en flux
Les analyses ont été effectuées à la Station Biologique de Roscoff avec l’aide de Dominique Mari et à
l’IUEM (UBO) avec Philippe Soudant.
Des analyses en cytométrie de flux ont été utilisées pour tenter notamment de
dénombrer les cellules en fonction de leur morphologie (e.g. bacilles) à partir d’échantillons
de culture du fermenteur.
Grâce à l’interaction d’un faisceau de rayons laser et de cellules en mouvement, la
cytométrie en flux permet le dénombrement, la mesure des caractéristiques, voire le tri des
cellules individuelles en suspension dans un courant d'eau saline (Figure 7a).
Les cultures microbiennes peuvent être analysées en cytométrie en flux après
marquage par un fluorochrome. Les échantillons de culture fixés au glutaraldéhyde ont été
décongelés et éventuellement dilués dans une solution stérile de NaCl 23g. L -1 , pour obtenir
une concentration cellulaire comprise entre 10 3 et 10 6 cellules. mL -1 . Les cellules ont ensuite
été marquées par un fluorochrome se fixant sur les acides nucléiques : le SYBR Green-I
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