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Introduction bibliographique matrice. L’utilisation d’amorces universelles dégénérées, plutôt que spécifique à un taxon, et le nombre de cycles de réplication ont une influence majeure sur l’image finale de la diversité des séquences amplifiées (Wintzingerode et al. 1997). L’ADN matrice originaire de l’échantillon initial est principalement amplifié pendant les 5-6 premiers cycles de la réaction de PCR, et l’amplification des fragments produits dans cette première phase a lieu au cours des cycles suivants. Les séquences les plus représentées et possédant une bonne affinité pour les amorces seront donc amplifiées préférentiellement (Dahllof & Kjelleberg 2002). Par conséquent, les microorganismes rares dans l’écosystème seront difficilement détectés. Les banques de clones Dans l’analyse d’un écosystème microbien, la PCR génère un mélange hétérogène de séquences, qui doivent être séparées avant séquençage. Le clonage de ces séquences est une méthode très employée. Les méthodes de criblage telles que l’ARDRA sont de moins en moins utilisées depuis l’essor des techniques de séquençage à haut débit. L’analyse d’un nombre de clones restreint permet alors d’identifier les membres dominants de la communauté étudiée. Le sol ou les sédiments sont par contre des biotopes dont la diversité microbienne peut dépasser les 1000 espèces et nécessiteraient l’analyse d’au moins autant de clones pour détecter toutes les espèces présentes. Par ailleurs, une étude récente a démontré que le nombre de copies des opérons rrn et l’hétérogénéité des séquences au sein d’un même organisme biaisait quantitativement les inventaires moléculaires vers les organismes présentant le plus grand nombre de copies (Crosby & Criddle 2003). 5.4 L’approche pluridisciplinaire et image actuelle de la diversité microbienne Les méthodes permettant d’analyser la diversité microbienne fournissent chacune un certain type d’informations et comportent des avantages et des inconvénients. Par exemple, la DGGE permet de suivre l’évolution d’une communauté, ou de comparer des communautés entre elles, mais les fragments d’ADN utilisés sont relativement courts et l’information phylogénétique correspondante est limitée. Par contre le clonage et le séquençage de gènes complets donne plus de précision sur la position phylogénétique des microorganismes détectés. Ces méthodes fournissent peu d’indices quant à la distribution spatiale et temporelle des cellules. La méthode du FISH utilisant des sondes oligonucléotidiques in situ révèle l’abondance relative des microorganismes ciblés mais n’apporte pas d’informations phylogénétiques précises relatives aux cellules détectées. De plus, l’obtention de souches pures en culture malgré les nouvelles méthodes de culture ne permet à ce jour de cultiver qu’une fraction des microorganismes de l’environnement. On remarque également que les microorganismes issus d’environnements naturels et cultivés in 80
Introduction bibliographique vitro par des méthodes traditionnelles sont rarement ceux qui dominent in situ d’un point de vue quantitatif ou fonctionnel. C’est principalement en adoptant une approche pluridisciplinaire que l’on accèdera à des informations significatives sur la biodiversité et le fonctionnement des écosystèmes (Figure 16). Echantillon environnemental Cultures d’enrichissement Extraction ARN total ADN total RT-PCR ADNc PCR Shotgun Communauté d’ADNr Hybridation DGGE-TTGE Clonage Sondes nucléotidiques Empreintes génétiques Banque de clones Séquençage des bandes Séquençage des clones Arbre phylogénétique Analyse comparative des séquences Banque de séquences Figure 16 : Schéma global des techniques moléculaires pour l’étude de la structure et de la dynamique des communautés microbiennes. 81
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