THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
0,8 mm) introduite entre les plaques . La vitesse de la pompe est fixée à 5 mL. min -1 ce qui
permet une bonne formation du gradient avant que les solutions ne polymérisent. La surface
du gel est recouverte de butanol saturé en eau (environ 1 mL) car le polyacrylamide ne
polymérise pas au contact de l’air. La polymérisation a lieu à 16°C pendant 4h.
- gel de concentration ("stacking") ou gel d’entassement. Il sert à regrouper les acides
nucléiques. Le butanol est rincé à l’eau distillée. Le gel de concentration est coulé à la
pipette et contient : 5 mL de solution d’Acrylamide/Bis à 0% de dénaturant + 50 µL d’APS
(100 mg. mL -1 ) + 50 µL de TEMED. Le peigne permettant la formation de 16 puits (volume
d’un puits : 30µL) est inséré dans ce gel entre les plaques. La polymérisation a lieu à 16°C
pendant 1h.
- dépôts et migration : une fois le peigne ôté, les puits doivent être soigneusement rincés
au tampon TAE 1X. Les plaques sont fixées à leur support, le tout est placé dans la cuve
remplie de TAE 1X (≈ 7L) préchauffé à 60°C. Les produits PCR sont mélangés à une
solution de dépôt. Le volume total ne doit pas dépasser 30 µL. La quantité d’ADN doit être
homogène dans tous les puits, dans la mesure du possible. Une pompe et une agitation
magnétique assurent une circulation du tampon dans la cuve et ainsi, une homogénéisation
de la température. L’électrophorèse est réalisée pendant 16 h à 70 V.
- révélation : les gels ont été colorés 15 min dans un bain de BET (0,5 mg. L -1 ), rincés 15
min à l’eau distillée, puis visualisés et photographiés sous UV (Fluor-S-MultiImager de
BioRad).
- découpage des bandes et réamplification des fragments. Les bandes ont été
découpées sous UV avec des lames stériles. Les ADN de chaque bande ont été élués
pendant une nuit à 4°C dans 50 µl d’eau stérile (ou TE 1X) en tube Eppendorf. Un microlitre
de l’ADN élué correspondant à chaque bande découpée a été réamplifié en suivant la
procédure précédemment décrite (3.2). La migration d’un aliquot de ces produits de PCR a
été réalisée en gel de DGGE comme décrit ci-dessus. Les produits de PCR fournissant une
seul bande à la même hauteur que la bande d’origine ont été purifiés sur colonnes QIAquick
(Qiagen) puis séquencés.
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