THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
- par filtration : les filtres utilisés ont une porosité de 0,22 µm (Millipore). Ce mode de
stérilisation préserve les éventuels composants thermolabiles du milieu (par ex. vitamines),
et permet d’éviter les réactions de Maillard (réactions à chaud entre les groupements
aldéhyde des sucres et les amines des peptides, "caramélisation"). Pour les milieux
contenant des sucres et des peptides, les solutions concentrées de sucres peuvent être
filtrées séparément avant d’être ajoutées aux milieux.
Pour réaliser des cultures en anaérobiose (Figure 2) , les milieux de culture stérilisés sont
entrés dans une enceinte anaérobie où ils sont répartis dans les flacons de culture.
L’enceinte anaérobie contient un mélange gazeux composé
de N 2 /H 2 /CO 2 (90/5/5). La circulation de ce mélange gazeux
à travers un catalyseur au palladium assure le maintien des
conditions de réduction. Le catalyseur est inefficace en
atmosphère humide et doit être souvent changé, ou
régénéré par passage à l’étuve 3h à 180°C. Les surfaces
internes de l’enceinte sont nettoyées avec un produit antibactérien
exempt d’oxygène (par ex ; Mercryl ® contenant un
ammonium quaternaire). Le matériel est décontaminé à
l’alcool avant d’être entré dans l’enceinte. Au laboratoire, une
enceinte anaérobie est consacrée à la répartition des milieux Figure 2 : Enceinte anaérobie
stériles, une seconde enceinte sert à la manipulation des
cultures (inoculation etc.).
L’entrée du matériel propre dans l’enceinte se fait via un sas : une pompe à vide permet
d’éliminer l’air, puis le sas est rempli d’azote, vidé une seconde fois, et rempli du mélange
N 2 /H 2 /CO 2 (90/5/5).
Dans l’enceinte, les milieux sont réduits par addition de 20 mL. L -1 de Na 2 S à 2,5% (w/v), soit
une concentration finale de 5 mg. L -1 .
2.2.3 Les expériences de cultures d’enrichissement réalisées en fiole pénicilline (batch)
Les cultures en flacon ont été réalisées dans des conditions analogues à celles des
cultures en fermenteur gas-lift en terme d’inoculum, de milieu, de pH et de température.
Ainsi, les cultures ont été réalisées en flacon pénicilline de 100 mL contenant 80 mL de
milieu "F1". A la différence du milieu préparé pour la culture en bioréacteur, ces milieux
contiennent 10 g. L -1 de soufre "fleur" ainsi que 6,05 g. L -1 de PIPES afin de tamponner le
milieu. Les milieux ont été inoculés à hauteur de 2% avec l’échantillon de cheminée
AT2E1-8. Les cultures ont été incubées en anaérobiose, à pH 6,5, à 60°C et à 90°C. Ces
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