THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Résultats complémentaires - Chapitre 2
Ces sous-cultures ont été suivies sur environ une semaine, et des prélèvements
quotidiens ont permis :
- la réalisation d’observations microscopiques et de comptages éventuels,
- la fixation des échantillons de culture en présence de formaldéhyde (3% final)
pour des analyses ultérieures de FISH, et en présence de glutaraldéhyde (0,25%
final) pour des analyses ultérieures de cytométrie de flux.
Lorsque des croissances ont été observées, les cellules présentaient dans leur
ensemble une morphologie de coque. Quelques bacilles ont été observés, mais
correspondaient à une dilution des cellules de l’inoculum, sans présenter de croissance dans
les conditions testées.
Les échantillons de culture correspondant à une croissance détectée ont été
analysés par cytométrie de flux après marquage des cellules au SYBR Green. L’objectif de
cette analyse était la mise en évidence éventuelle de plusieurs populations différentiables
par leur morphologie. Ainsi les cellules appartenant au genre Marinitoga peuvent avoir une
morphologie de coccobacille qui peut facilement être confondue avec celle de coques ‘vrais’
tels que les Thermococcales. Toutefois, cette technique n’a pas permis d’identifier plusieurs
populations de coques en fonction de leur morphologie.
Les analyses de FISH ont été réalisées sur des sous-cultures "positives" avec les
sondes ARCH915 et EUB338 utilisées en double hybridation. Pyrococcus abyssi (souche
GE5) et Marinitoga piezophila (souche KA3) ont été choisis comme témoins positifs, archéen
et bactérien respectivement. Ces analyses ont montré que l’ensemble des coques
correspondaient à des Archaea. La mise en évidence de Bacteria dans les sous-cultures en
flacon n’a donc pas été possible.
Les sous-culture n’ayant pas permis de cultiver les bactéries détectées par approche
moléculaire, des expériences de RT-PCR ont été mises en œuvre pour rechercher la
présence d’ARNr 16S bactériens directement dans les échantillons de culture du
bioréacteur, la détection d’ARN constituant un indice de l’activité des cellules détectées,
contrairement à la détection d’ADNr 16S. Des culots cellulaires (correspondant à ceux ayant
servi au clonage) stockés à –20°C ont fait l’objet d’une extraction des ARN totaux. Une
culture pure de Marinitoga piezophila (souche KA3) a été utilisée comme témoin positif ;
mais il n’a pas été possible de montrer la présence d’ARN bactérien dans les échantillons du
bioréacteur. Des ARN archéens ont pourtant été mis en évidence à partir de ces mêmes
échantillons. Une culture de Pyrococcus abyssi (souche GE5) a alors été utilisée comme
témoin positif. Le seuil de détection de la méthode utilisée pourrait constituer une limite pour
la mise en évidence des ARN bactériens (la communauté bactérienne représente peut-être
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