THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
‣ Le cycle suivant a été réalisé grâce au Robocycler Gradient 96 (Stratagene) :
3 min 94°C (dénaturation initiale)
1 min 94°C (dénaturation)
1 min 30 49°C* (hybridation) 30 cycles
2 min 72°C (élongation)
6 min 72 °C (élongation finale)
1 min 6°C (conservation)
* la température d’hybridation appliquée dépend du couple d’amorces utilisé. Elle est choisie
généralement à Td - 5°C, Td étant la température de demi-dénaturation de l’amorce
dépendant de sa composition en base. La relation suivante en donne une
approximation utilisable pour des amorces inférieures à 18 oligonucléotides (elle ne tient pas
compte de la concentration en sels) : Td = 4 x (G+C) + 2 x (A+T).
‣ Les amorces suivantes (Tableau 3) sont utilisées pour les différentes réactions
d’amplification.
‣ En vue de l’analyse par DGGE, des amorces spécifiques des domaines Archaea (344F-
GC et 915R (Casamayor et al. 2000)) et Bacteria (341F-GC et 907R (Muyzer et al. 1993,
Muyzer & Smalla 1998)) ont été utilisées pour l’amplification par PCR de la région variable
v3 de l’ADNr 16S. Ces amorces ont pour particularité de posséder un "GC-clamp" (Figure 9).
Elles sont utilisées à raison de 50 pmol par réaction de PCR, dans un volume réactionnel
total de 100 µL.
La PCR a été réalisée grâce à des cycles en "touchdown" : la température d’hybridation est
abaissée d’un degré tous les deux cycles pour les 20 premiers cycles, et les 15 derniers
cycles sont réalisés à la température la plus basse (= la température d’hybridation attendue).
Les gammes de températures utilisées sont : 71 à 61°C pour l’amplification des ADNr
archéens, et 65 à 55°C pour l’amplification des ADNr bactériens. Cette procédure réduirait la
formation des sous-produits aspécifiques (Don et al. 1991, Muyzer et al. 1993). Les produits
amplifiés ont été vérifiés sur gel d’agarose 0,8% (voir 3.1 " contrôle").
GC-clamp (40 pb)
P3
P1
ADNr 16S
P2
Figure 9 : Schéma de la région d’ADNr amplifiée par PCR dans cette étude. Les amorces 1 et 2
amplifient un fragment d’environ 570 pb de l’ADNr 16S de E. coli. L’amorce 3 correspond à l’amorce 1
avec incorporation en 5’ d’un "GC-clamp" de 40 pb.
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