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Introduction bibliographique constitue le fondement de l’approche moléculaire, indépendante de l’approche culturale. Les sous-unités de l’ATPase, les facteurs d’élongation, les ARN polymérases et le facteur σ du rpoB ont été testés comme alternative aux gènes ribosomaux. L’information phylogénétique déduite de l’étude de ces gènes confirme généralement celle obtenue de l’analyse des gènes de l’ARNr 16S (Rossello Mora & Amann 2001). Figure 15 : Structure secondaire de l’ARNr 16S d’E. coli. (www.aw-bc.com/mathews/ ch27/fi27p15.gif). 72
Introduction bibliographique 5.3.2 Méthodologies La caractérisation d’un organisme en terme de phylotype ne nécessite qu’une séquence génétique et non une cellule fonctionnelle. Par conséquent, les gènes ou fragments de gènes codant pour l’ARNr 16S peuvent être sélectivement amplifiés par PCR à partir de mélanges complexes d’ADN obtenus directement d’échantillons environnementaux. Cette méthode permet alors de s’affranchir de l’étape de culture des microorganismes dans un but d’identification de ces derniers. Un panel de séquences oligonucléotidiques, universelles pour toutes les Bacteria ou les Archaea, ou ciblant des niveaux taxonomiques spécifiques (phylum, famille, genre), est utilisé pour amplifier spécifiquement les gènes. La méthode de clonage permet d’isoler individuellement les gènes amplifiés et de les séquencer facilement. Puis les analyses phylogénétiques sont basées sur la comparaison des séquences avec celles disponibles dans des banques de données internationales. L’arbre phylogénétique finalement crée représente les relations phylogénétiques entre les séquences nouvellement obtenues et des séquences de référence. En théorie, les banques de clones représenteraient l’ensemble des molécules amplifiées par PCR, et fourniraient par conséquent une image instantanée de la diversité microbienne de l’échantillon environnemental. Cette technologie est a priori applicable à n’importe quel environnement et peut permettre la détection de microorganismes inaccessibles en culture. L’analyse des banques de clones pour accéder à la diversité microbienne d’échantillons environnementaux a longtemps été freinée par la fastidieuse étape du séquençage. Différentes méthodes de criblage ont été utilisées pour explorer la diversité moléculaire des banques constituées d’un grand nombre de clones. L’ARDRA (amplified rDNA restriction analysis) est une méthode de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) appliquée aux gènes ribosomaux. Les produits d’amplification des fragments d’ADNr clonés sont incubés en présence d’une ou plusieurs enzymes de restriction. L’ensemble des fragments obtenus fournissent pour chaque ADNr cloné des profils électrophorétiques qui sont comparés entre eux. La diversité des profils obtenus reflète grossièrement la diversité de la communauté microbienne étudiée. L’utilisation de l’ARDRA peut permettre de réduire le nombre de clones à séquencer. Néanmoins, cette méthode peut être laborieuse si on considère un grand nombre de clones, et une lecture précise des gels électrophorétique s’avère souvent difficile. Cette méthode appliquée au criblage de banques de clones présente moins d’intérêt depuis le développement récent des techniques de séquençage à haut débit. La T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) est une variante de la méthode précédente. Une amorce marquée en 5’ par un fluorochrome est utilisée dans 73
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