THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Introduction bibliographique
l’étape d’amplification par PCR des ADN ribosomaux. Les produits amplifiés sont digérés par
une ou plusieurs enzymes de restriction ce qui génère un ensemble de fragments de taille
variable selon la séquence de l’ADN et la spécificité des enzymes de restriction. Seuls les
fragments de restriction terminaux marqués par un fluorochrome sont visualisés et mesurés
grâce à un séquenceur automatique.
Indépendamment du clonage, un ensemble de méthodes permet aisément de
comparer la diversité microbienne de plusieurs communautés microbiennes complexes, ou
l’évolution de la diversité d’une même communauté au cours du temps. Ces méthodes
fournissent un "profil" ou une "empreinte génétique" de la diversité microbienne par
séparation physique des acides nucléiques sur gel d’électrophorèse. Ces techniques
reposent sur les différences de migration de séquences nucléotidiques, non pas en fonction
de leur taille, comme dans le cas d’électrophorèses classiques, mais en fonction de leur
composition en nucléotides.
La technique de DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) a été développée
au début des années 1990 (Muyzer et al. 1993). Cette technique est basée sur la séparation
d’un mélange d’ADN double-brin de même taille (ex : ADNr 16S amplifiés par PCR), dans un
gel de polyacrylamide par action simultanée de la chaleur et d’un gradient linéaire de
dénaturant (urée, formamide). La mobilité des fragments dans le gel est liée à leur
température de fusion Tm (Tm = "temperature melting"), c’est-à-dire la température à
laquelle le duplex d’ADN est dénaturé à 50%. Le Tm est conditionné par :
- le nombre de liaisons hydrogène entre les bases complémentaires. Une liaison GC
comporte 3 liaisons hydrogène qui sont détruites à une température supérieure à celle d’une
liaison AT contenant 2 liaisons hydrogène,
- l’attraction entre bases voisines sur un même brin d’ADN.
La mobilité d’un fragment d’ADN dans un gel dénaturant va décroître lorsque les
zones nucléotidiques à faible Tm se dissocient. Complètement dénaturé et sous forme
simple brin, la migration du fragment est quasi stoppée. Ainsi, la migration de fragments
présentant des séquences différentes s’arrêtera à des positions distinctes dans un gel
dénaturant. Les fragments d’ADNr 16S sont couplés à une séquence de 40 pb riche en
guanine et cytosine apportée par l’une des amorces au cours de la PCR et appelée "GC
clamp". Ce clamp, en raison de sa très haute température de fusion, joue un rôle d’ancrage
et de stabilisation des fragments dans le gel pour favoriser une meilleure séparation des
fragments. Théoriquement, la technique de DGGE permet de séparer des fragments qui
diffèrent d’une seule base nucléotidique. Chaque bande, ayant une mobilité propre, peut
correspondre à une espèce ou à un groupe d'espèces taxonomiquement proches ou non.
Les bandes peuvent ensuite être excisées du gel. Une réamplification des fragments par
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