THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Introduction bibliographique
5.3.2 Méthodologies
La caractérisation d’un organisme en terme de phylotype ne nécessite qu’une
séquence génétique et non une cellule fonctionnelle. Par conséquent, les gènes ou
fragments de gènes codant pour l’ARNr 16S peuvent être sélectivement amplifiés par PCR à
partir de mélanges complexes d’ADN obtenus directement d’échantillons environnementaux.
Cette méthode permet alors de s’affranchir de l’étape de culture des microorganismes dans
un but d’identification de ces derniers.
Un panel de séquences oligonucléotidiques, universelles pour toutes les Bacteria ou
les Archaea, ou ciblant des niveaux taxonomiques spécifiques (phylum, famille, genre), est
utilisé pour amplifier spécifiquement les gènes. La méthode de clonage permet d’isoler
individuellement les gènes amplifiés et de les séquencer facilement. Puis les analyses
phylogénétiques sont basées sur la comparaison des séquences avec celles disponibles
dans des banques de données internationales. L’arbre phylogénétique finalement crée
représente les relations phylogénétiques entre les séquences nouvellement obtenues et des
séquences de référence. En théorie, les banques de clones représenteraient l’ensemble des
molécules amplifiées par PCR, et fourniraient par conséquent une image instantanée de la
diversité microbienne de l’échantillon environnemental. Cette technologie est a priori
applicable à n’importe quel environnement et peut permettre la détection de
microorganismes inaccessibles en culture.
L’analyse des banques de clones pour accéder à la diversité microbienne
d’échantillons environnementaux a longtemps été freinée par la fastidieuse étape du
séquençage. Différentes méthodes de criblage ont été utilisées pour explorer la diversité
moléculaire des banques constituées d’un grand nombre de clones.
L’ARDRA (amplified rDNA restriction analysis) est une méthode de RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism) appliquée aux gènes ribosomaux. Les produits
d’amplification des fragments d’ADNr clonés sont incubés en présence d’une ou plusieurs
enzymes de restriction. L’ensemble des fragments obtenus fournissent pour chaque ADNr
cloné des profils électrophorétiques qui sont comparés entre eux. La diversité des profils
obtenus reflète grossièrement la diversité de la communauté microbienne étudiée.
L’utilisation de l’ARDRA peut permettre de réduire le nombre de clones à séquencer.
Néanmoins, cette méthode peut être laborieuse si on considère un grand nombre de clones,
et une lecture précise des gels électrophorétique s’avère souvent difficile. Cette méthode
appliquée au criblage de banques de clones présente moins d’intérêt depuis le
développement récent des techniques de séquençage à haut débit.
La T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) est une variante
de la méthode précédente. Une amorce marquée en 5’ par un fluorochrome est utilisée dans
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