THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
3.5 Clonage
Des banques de clones ont été construites en utilisant le kit TOPO TA cloning
(Invitrogen ® ) à partir des pools d’ADNr 16S amplifiés par PCR et obtenus à partir de :
- l’échantillon de cheminée AT2E1-8,
- deux échantillons de chacune des cultures d’enrichissement en fermenteur gas-lift à 90°C
et 60°C, collectés à T7 et T28, i.e 7 è jour et 28 è jour,
- trois échantillons des cultures d’enrichissement en flacon collectés à deux temps distincts,
et après repiquage (décrit plus haut : 2.2.3), et ce pour chacune des températures : 90°C et
60°C.
Le principe du clonage à l’aide de ce kit repose sur une activité de la Taq polymérase
qui ajoute une désoxyadénosine (A) aux extrémités 3’ des brins néosynthétisés. Le vecteur
linéarisé possède une déoxythymidine (T) en 3’, ce qui permet une ligation efficace du
produit de PCR avec le vecteur, grâce à l’action d’une topoisomérase à température
ambiante.
Le protocole de clonage dans le vecteur pCR 2.1-TOPO et de transformation est
celui décrit par le fabricant (voir aussi Annexe 2). Les étapes sont les suivantes :
- ligation : le plasmide pCR ® 2.1-TOPO linéarisé se referme sur un fragment amplifié par
PCR. Ce plasmide possède deux gènes de résistance, à l’ampicilline et à la kanamycine, un
gène lac Z qui code pour la β-galactosidase et contient le site d’insertion, et des sites
d’hybridation pour les amorces M13F et M13R.
- transformation : le vecteur est inséré dans une cellule hôte compétente : E. coli TOP10F’
(One Shot ® ). La perméabilisation de la membrane est obtenue par choc thermique et par
action du β-mercaptoéthanol.
- mise en culture des cellules transformées sur milieu LB gélosé contenant 50 µg. mL -1
d’ampicilline. Un étalement d’IPTG, inducteur du gène de la β-galactosidase, et de X-gal,
substrat de la β-galactosidase, est réalisé sur les milieux gélosés avant inoculation, et
incubation (15-20 h) à 37°C.
Milieux et solutions :
- milieu LB (Luria Bertani) : 10 g. L -1 tryptone, 5 g. L -1 d’extrait de levure, 10 g. L -1 de NaCl.
- milieu LB gélosé : milieu LB + 15 g. L -1 d’agar avant autoclavage.
- IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) : 100 mM
- X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside) : 40 mg. mL -1 dans du diméthylformamide.
- analyse des clones : l’ampicilline ajoutée dans le milieu LB gélosé permet de sélectionner
la croissance des cellules effectivement transformées par le vecteur, qui est porteur du gène
de résistance à cet antibiotique. La sélection des cellules possédant le plasmide recombiné
se fait par la couleur des colonies. Lorsque le plasmide ne possède pas l’insert, le gène Lac
Z n’est pas interrompu et la β-galactosidase est exprimée (par induction à l’IPTG). La
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