THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
Les échantillons ont finalement été chargés sur un gel de polyacrylamide à 6 ou 8% (w/v)
dans du TAE 1 X comportant :
- un gradient de dénaturant de 50 à 80% d’urée et formamide (UF) pour l’analyse des
fragments archéens,
- un gradient de 35 à 80% UF pour l’analyse des fragments bactériens.
NB : 100% UF correspondent à 7M d’urée et 40% (v/v) de formamide.
Une gamme de solutions contenant différents pourcentages de dénaturant a été utilisée
(Tableau 4). Ces solutions sont préparées au préalable et stockées à 4°C.
Tableau 4 : Composition des solutions dénaturantes utilisées pour la réalisation des gels de DGGE.
% dénaturant 0 35 50 80 100
Acrylamide/Bis (37,5 :1) 40% (Biorad) a 15 15 15 15 15
TAE 50X (Biorad) b 1 1 1 1 1
Formamide déionisé (Sigma) 0 14,7 21 33,6 42
Urée (Sigma) 0 14,7 21 33,6 42
H 2 O MilliQ QSP 100 100 100 100 100
a Acrylamide : N, N’-Methylenbisacrylamid (37,5 :1) (substance cancérigène et neurotoxique).
b
TAE 1x : 40 mM Tris, 20 mM acide acétique, 1 mM EDTA, pH 8,3.
La réalisation d’un gel comporte les étapes suivantes :
- nettoyage des plaques à l’eau savonneuse, rinçage à l’eau distillée puis à l’éthanol,
séchage et essuyage soigneux.
- montage des deux plaques et des deux "spacers" (pièces d’écartement, 1 mm).
- gel "bouchon" (facultatif). Il est coulé à la pipette dans un but d’étanchéité, et contient : 1
mL de solution d’Acrylamide/Bis à 0% de dénaturant + 10 µL d’APS (ammonium persulfate,
BioRad) à 100 mg. mL -1 (aliquot décongelé extemporanément) + 10 µL de TEMED
(N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylenediamine, BioRad). La matrice est crée par la polymérisation
d’acrylamide et de bis-acrylamide. La grosseur des pores formés est fonction de la
concentration d’acrylamide. Plus la concentration est élevée, plus les pores seront petits.
- gel dénaturant. Ce gel est coulé à l’aide d’un "formeur de gradient" : c’est un système à
deux colonnes, l’une contenant la solution la plus dénaturante, l’autre la solution la moins
dénaturante, qui permet la réalisation d’un gradient de dénaturant au sein du gel. Chaque
colonne contient : 12 mL de solution dénaturante + 12 µL de TEMED + 120 µL d’APS (100
mg. mL -1 ). L’ensemble est placé sous agitation. L’ouverture du robinet de jonction amorce le
mélange des solutions : la solution la plus dénaturante est progressivement diluée par la
moins dénaturante (⇒ gel plus dénaturant en bas, moins dénaturant en haut). Le gel est
coulé via un tuyau Masterflex associé à une pompe péristaltique et branché à une aiguille (∅
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