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Matériel et méthodes 4.4 Caractérisation métabolique Différents milieux ont été réalisés pour tester l’utilisation d’accepteurs d’électrons, de sources de carbone et/ou d’énergie et de sources d’azote, et pour tester la croissance en autotrophie et l’effet de différentes phases gazeuses. Des témoins non-inoculés ont été réalisés pour chaque condition testée. La croissance a été suivie par mesure de l’absorbance à 600 nm et dans certains cas par comptage cellulaire. Des analyses par HPLC et chromatographie en phase gazeuse ont également été effectuées, soit pour confirmer la consommation de certains substrats, soit pour identifier des produits du métabolisme. Le milieu de base utilisé est le suivant : - Sea salt 30 g. L -1 , - MES 3,9 g. L -1 , - extrait de levure 0,1 g. L -1 , - vitamines de Balch* 10 mL. L -1 - minéraux traces de Balch* 10 mL. L -1 - ajustement pH 6 *(Balch et al. 1979). 4.4.1 Accepteurs d’électrons Au milieu de base sont ajoutés les accepteurs d’électrons suivants : - thiosulfate 20 mM, - sulfate 20 mM, - sulfite 1 mM, - nitrate 20 mM, - nitrite 1 mM, - cystine 50 mM - soufre 10 g. L -1 . L’absorbance à 600 nm et des comptages cellulaires ont été effectués après 8 h d’incubation, et comparés à une croissance sur un milieu sans accepteur d’électrons ajouté. La production de sulfure d’hydrogène (H 2 S) a été recherchée : elle résulte de la capacité de la souche à réduire des composés soufrés. Pour cela, une goutte de la culture a été déposée sur une bande d’acétate de plomb (Whatman) : l’apparition d’un brunissement témoigne de la présence de H 2 S par rapport à la coloration obtenue avec un témoin non-inoculé, incubé dans les mêmes conditions. 124
Matériel et méthodes 4.4.2 Sources de carbone et/ou d’énergie Les sources de carbone ajoutées sont présentées ci-dessous. Il s’agit de sucres (monosaccharides, disaccharides, polysaccharides), d’acides organiques, d’alcool, de sources de peptides et d’acides aminés et de substrats complexes. ‣ cellobiose 5 g. L -1 ‣ acétate 2 g. L -1 carboxyméthylcellulose 5 g. L -1 chacun à 0,1 g. L -1 glucose 5 g. L -1 pyruvate 2 g. L -1 maltose 5 g. L -1 ‣ éthanol 5 mL. L -1 fructose 5 g. L -1 ‣ extrait de levure 2 g. L -1 galactose 5 g. L -1 bouillon cœur-cervelle 2 g. L -1 ribose 5 g. L -1 peptone 2 g. L -1 amidon 5 g. L -1 tryptone 2 g. L -1 cellulose 5 g. L -1 caséine 2 g. L -1 glycogène 5 g. L -1 Casaminoacide 2 g. L -1 chitine 5 g. L -1 kératine 2 g. L -1 pectine 5 g. L -1 ‣ solution de 20 acides aminés L’extrait de levure à 0,1 g. L -1 a été conservé dans le milieu de base uniquement pour le test de la consommation des sucres, des acides organiques et de l’alcool. Dans une seconde série de cultures, cette concentration en extrait de levure a été augmentée à 1 g. L -1 . Les cultures ont été réalisées à 60°C. Une estimation de la croissance a été effectuée après 8 h et 24 h d’incubation, par mesure de l’absorbance et/ou comptage cellulaire. Des analyses par HPLC ont permis de confirmer la consommation de certains substrats. Les cultures "positives" ont été repiquées par dilution au 20 ème sur le même milieu pour confirmer la croissance. 4.4.3 Sources d’azote Le milieu de base utilisé était exempt d’extrait de levure et contenait du glucose (5 g. L -1 ). Les sources d’azote testées sont : - l’extrait de levure 0,2 g. L -1 , - l’urée 0,2 g. L -1 , - le NH 4 Cl 1 g. L -1 . Les cultures ont été réalisées à 60°C. La croissance cellulaire a été estimée après 8 h et 24 h d’incubation. Les cultures "positives" ont été repiquées au 20 ème sur le même milieu pour confirmer la croissance. 4.4.4 Test de la croissance en autotrophie Les milieux ont été préparés sans aucune source carbonée. Le milieu de base exempt d’extrait de levure a été complémenté, soit en NH 4 Cl (1 g. L -1 ), soit en extrait de levure (0,1 g. L -1 ) comme source d’azote. Les cultures ont été incubées à 60°C avec une phase gazeuse H 2 /CO 2 (80/20) (voir 4.4.6). Une estimation de la croissance a été effectuée 125
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