THESE Anne POSTEC DiversitÃƒÂ© de populations microbiennes ...

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Introduction bibliographique très coûteux (aciers spéciaux, titane). Le fermenteur gas-lift permet de cultiver des Thermococcales en absence de soufre : la mise en place d’un balayage de la culture par un gaz inerte (N 2 , Ar…) permet l’élimination des produits volatiles de la fermentation tel que l’hydrogène potentiellement toxique pour les microorganismes cultivés (Raven et al. 1992). De plus la production d’hydrogène sulfuré, gaz toxique, est également évitée. Ce système permet donc de mener des fermentations sans soufre avec des matériaux classiques. Ce système a d’abord été optimisé pour la culture de Pyrococcus furiosus, archée hyperthermophile de l’ordre des Thermococcales et a permis : - l’obtention de concentrations cellulaires élevées et l’utilisation de biomasse pour la purification d’enzymes natives (Raven et al. 1992), - la mise au point d’un milieu minimum pour la culture de cette souche en fermenteur (Raven & Sharp 1997), - l’étude physiologique de Pyrococcus abyssi (Godfroy et al. 2000), - et récemment l’optimisation des conditions de croissance de Thermococcus hydrothermalis en fermenteur ainsi que la mise au point d’un milieu défini et minimum sans soufre (Postec et al. 2005, voir annexe 4). Par ailleurs, la structure de communautés microbiennes cultivées en continu a fait l’objet d’analyses temporelles mettant en évidence une succession des populations, et ainsi l’existence d’une dynamique au sein de cultures en continu. Un digesteur anaérobie alimenté en glucose et inoculé par un échantillon de boue activée a été suivi pendant 107 jours (Leclerc et al. 2001). L’analyse de la population par SSCP a permis d’affilier les populations archéennes dominantes à des méthanogènes, et de mettre en évidence une dynamique au sein de cette population : un changement important de structure a été observé dans les premiers jours ainsi que l’apparition d’une nouvelle espèce dominante (Methanobacterium formicicum) à partir du 21 è jour et ce jusqu’à la fin de l’expérience, espèce qui n’avait pas été détectée au 1 er jour. Dans l’étude des process de bioremédiation, la biodégradation de l’hexadécane a été analysée in vitro. Une culture continue réalisée en bioréacteur a été alimentée par de l’hexadécane comme seule source de carbone, et inoculée par une suspension de sédiments marins côtiers de la mer du Nord. Après une phase initiale de batch de 48h, le taux de dilution a été augmenté de 0,008 à 0,047 h -1 . L’utilisation de sondes oligonucléotidiques a permis de mettre en évidence des changements importants dans la structure de la population cultivée : une grande quantité de Cytophaga/Flavobacteria a été détectée en début de culture, laissant place à une communauté dominée par des γ- Proteobacteria après augmentation du taux de dilution (Bruns & Berthe-Corti 1998). 84
Introduction bibliographique Le fermenteur "gas-lift" a été utilisé pendant ma thèse pour réaliser des cultures d’enrichissement en continu à haute température à partir d’échantillons de cheminée hydrothermale, afin d’accéder à une fraction de la population microbienne jusque là incultivée. Dans des cultures classiques d’enrichissement en batch, les espèces les plus représentées et/ou poussant le plus vite prennent le dessus, consomment les substrats et relarguent dans le milieu des produits du métabolisme (H 2 S, H 2 , acides organiques etc.) qui peuvent inhiber la croissance des autres espèces. L’utilisation du fermenteur gas-lift permet de réaliser des cultures en conditions contrôlées : le pH, la température et le balayage gazeux sont régulés à une valeur stable. Le fermenteur permettra aussi la réalisation de cultures en continu : dans ces conditions le milieu, et donc les substrats, sont apportés en continu avec un débit contrôlé. L’évolution de la population dans le fermenteur pourra être suivie au cours du temps, grâce à l’utilisation d’outils moléculaires. L’idée de départ était surtout que la culture en continu, avec des conditions contrôlées et un balayage gazeux efficace, allait permettre la croissance des espèces les moins représentées dans l’échantillon, ou présentant de longs temps de latence et/ou temps de génération. Après un chapitre "Matériel et méthodes" développant principalement les méthodes de cultures et les techniques moléculaires utilisées, les résultats sont présentés de la façon suivante : - étude de la diversité archéenne et bactérienne d’une cheminée hydrothermale du site Rainbow, par réalisation d’inventaires moléculaires (Chapitre 1), - la réalisation de cultures d’enrichissement en flacon et en bioréacteur à partir de cette cheminée, et l’analyse des populations cultivées : • enrichissements à 90°C (Chapitre 2), • enrichissements à 60°C (Chapitre 3), - la caractérisation d’une nouvelle espèce bactérienne thermophile appartenant au genre Marinitoga isolée d’une culture d’enrichissement en bioréacteur (Chapitre 4). 85
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