THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
a) la réaction de séquence (PCR).
Le principe du séquençage est celui développé par Sanger et basé sur l’incorporation
de didésoxynucléotides. Une réaction de PCR est couplée à ce principe pour amplifier le
signal. La polymérase permettant l’amplification du gène d’intérêt est mise en présence
d’oligonucléotides non marqués (dNTP) et de didésoxynucléotides (ddNTP) marqués par des
fluorochromes différents selon leur nature. L’incorporation d’un ddNTP entraîne l’arrêt de
l’élongation. Ainsi, on obtient théoriquement des séquences d’ADN de toutes tailles dont le
dernier nucléotide est fluorescent.
La réaction de séquence utilise la chimie du "Big Dye Terminator" (Applied
Biosystem) selon les recommandations du fabricant. La solution commerciale "Big Dye
Terminator V3.1" contient les dNTP, les ddNTP marqués ainsi que l’ADN polymérase. Le
mélange réactionnel pour une réaction contient : le tampon de dilution du Big-Dye : 0,75 µL,
la solution Big-Dye V3.1 : 0,5 µL, l’amorce : 5 pmol, l’ADN (ADN génomique : 1,5 à 2 µg ou
produit PCR : 30 à 50 ng ou plasmide : 100 ng), et l’eau Milli-Q stérile : qsp 5µL. Les
amorces utilisables sont présentées au paragraphe 3.2 (Tableau 5). La réaction s’effectue
sur un thermocycleur dans les conditions suivantes :
Tableau 5 : Cycle de PCR pour la réaction de séquence.
température 94°C 55°C 60°C 4°C
1 cycle 5 min x x x
50 cycles 30 sec 30 sec 4 min x
1 cycle x x x infini (99:59)
Les produits amplifiés sont ensuite purifiés avec le kit "Montage SEQ96 Sequencing
Reaction Cleanup" (Millipore).
L’utilisation du robot pipeteur "Tecan Genesis 150" permet le traitement simultané de
4 plaques de 96 puits, et peut prendre en charge : l’extraction de plasmides, la répartition du
mélange réactionnel et l’addition de l’ADN pour la réaction de séquence, la purification des
produits amplifiés.
b) le séquençage.
Il a été réalisé grâce à un séquenceur automatique (Abi prism 3100 ® GA, Applied
Biosystem) composé principalement d’un faisceau de 16 capillaires, d’une anode, d’une
cathode, et d’une cellule de détection (LASER) (voir Figure 10). Le produit d’amplification y
est analysé. La séparation des fragments d’ADN à un nucléotide près s’effectue par
électrophorèse dans un polymère (POP4 ou POP6) circulant à l’intérieur des capillaires. Le
faisceau de capillaires passe ensuite devant un faisceau LASER qui excite les
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