THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
Tableau 8 : Composition du milieu GYPS-pH6.
Composants
Concentrations
glucose 5 g. L -1
extrait de levure 0,5 g. L -1
peptone 1 g. L -1
Sea Salts 30 g. L -1
tampon MES 3,9 g. L -1
La croissance de la souche a été estimée par comptage en cellule de Thoma, ou par
mesure de la densité optique. Dans ce cas, la concentration cellulaire a été déterminée
indirectement par la turbidité du milieu due à la croissance cellulaire. L’absorbance à 600 nm
a été mesurée grâce à un spectrophotomètre (Spectronic 401, Milton Roy). Les cultures en
tubes de Hungate sur milieu GYPS sans soufre permettent une lecture directe de
l’absorbance par insertion des tubes dans le spectrophotomètre, après homogénéisation. La
proportionnalité entre l’absorbance à 600 nm et la concentration cellulaire n’est valable que
pour une gamme de concentrations cellulaires à définir. Une corrélation a été établie entre
l’absorbance à 600 nm et le dénombrement cellulaire par comptage en cellule de Thoma.
Bien que la technique de comptage en cellule de Thoma puisse être utilisée en théorie sur
une gamme plus large de concentrations cellulaires (à partir de 10 6 cellules. mL -1 , sans limite
supérieure), la technique de lecture de l’absorbance sera préférée lorsque de nombreuses
mesures de concentration cellulaire sont nécessaires à l’expérimentation.
4.2 Caractérisation morphologique de l’isolat
4.2.1 Microscopie optique
La morphologie, le mode de division et la mobilité des cellules ont été déterminés par
des observations au microscope à contraste de phase Olympus BX60, aux grossissements
X400 et X1000. L’observation des cellules dans des milieux contenant des substrats
complexes (e.g. polysaccharides), du soufre ou des précipités minéraux est facilitée par un
marquage spécifique des cellules au DAPI et une observation en épifluorescence (voir
2.4.2).
4.2.2 Détermination du Gram
Les cellules fixées sont colorées au cristal violet et à l’iode, puis traitées à l’alcool.
Les cellules à Gram positif (peptidoglycane très épais) conservent une couleur violette après
ce traitement. Les cellules à Gram négatif (peptidoglycane fin, espace périplasmique et
membrane externe) sont décolorées par l’alcool et apparaissent roses après une contre-
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