THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Résultats - Chapitre 1
1 Diversité morphologique
Une extraction des cellules a été réalisée à partir de l’échantillon de cheminée
AT2E1-8 selon le protocole décrit par Harmsen et al. (Harmsen et al. 1997b). Un marquage
au DAPI et une observation en epifluorescence de ces cellules a permis de mettre en
évidence une importante diversité morphologique : coques de taille variable, diplocoques,
bâtonnets de longueur variable, droits ou incurvés, chaînettes de bacilles etc. (Figure 1). Le
marquage des cellules au moyen de sondes oligonucléotidiques spécifiques (FISH) des
Archaea et des Bacteria n’a malheureusement pas pu être réalisé, par manque
d’échantillons conditionnés pour ce type d’étude.
Figure 1 : Cellules totales extraites de l’échantillon de cheminée et observées en épifluorescence
(X1000) après marquage au DAPI.
2 Extraction des acides nucléiques totaux et amplification des ADNr 16S
A partir de 15 mL de suspension aqueuse de l’échantillon de cheminée AT2E1-8 et
après agitation vigoureuse, les acides nucléiques totaux ont été extraits avec succès. Les
ADNr 16S ont ensuite été amplifiés à l’aide d’amorces spécifiques des domaines Archaea et
Bacteria qui permettent d’amplifier des fragments de 1900 et 1500 pb respectivement. Pour
la DGGE, les amorces utilisées contiennent un GC-clamp de 40 nucléotides en 5’. Elles
permettent l’amplification de fragments de 560 pb environ, fragments qui correspondent à la
région hypervariable V3 des ADNr 16S archéens et bactériens. Les ADNr 16S obtenus par
amplification ont été séparés par DGGE et par clonage. La DGGE permet une séparation
directe des fragments alors que le clonage est une méthode indirecte. Le séquençage des
fragments obtenus par les deux méthodes permet d’accéder à la diversité des séquences, et
ainsi d’obtenir une image de la diversité des microorganismes présents dans la cheminée
AT2E1-8.
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