THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
β-galactosidase hydrolyse le X-Gal, ce qui génère un produit bleu. Lorsque l’insert est
présent, le gène Lac Z est interrompu, il n’y a pas de production de β-galactosidase dans ce
cas et les colonies obtenues sont blanches. Une incubation des boîtes de clones ½ journée
à température ambiante ou 2 h à 4°C facilite la lecture du criblage blanc/bleu. Les colonies
blanches sont repiquées sur milieu LB gélosé (contenant de l’ampicilline et recouvert de Xgal
et IPTG, voir ci-dessus) pour vérifier la couleur des colonies. Les colonies blanches sont
repiquées parallèlement sur milieu LB (+ ampicilline) pour conservation des clones.
- vérification de la présence de l’insert : les colonies sont reprises dans 100 µL à 1 mL d’eau
Milli-Q stérile. Les fragments insérés sont amplifiés par PCR à l’aide des amorces M13F et
M13R (25 pmol de chaque, température d’hybridation : 55°C). La taille de l’insert est vérifiée
par électrophorèse sur gel d’agarose 0,8% (voir 3.2 et 3.1).
3.6 Séquençage
Selon le nombre de réactions de séquence à réaliser, la stratégie employée est
différente.
‣ Pour un nombre réduit de réactions de séquence, le séquençage a été réalisé par la
société Genome Express S.A. (Grenoble). C’est le cas :
- des fragments d’ADN obtenus par DGGE,
- de réactions de PCR isolées,
- de clones cultivés en tubes 15-20 h à 37°C dans 2 mL de LB 2X (10 g. L -1 tryptone,
5 g. L -1 d’extrait de levure, 10 g. L -1 de NaCl) contenant 50 µg. mL -1 d’ampicilline. Les
plasmides ont été extraits pour chaque culture avec le kit QIAprep Miniprep (Quiagen).
‣ Pour un grand nombre de réactions de séquences (> à 96 réactions), le travail a été
effectué en microplaque de 96 puits qui ont été traitées à la plate-forme OUEST-Génopole à
Roscoff (http://www.sb-roscoff.fr/SG/).
- dans le cas de produits de PCR, ils ont été purifiés à l’aide du Kit de purification
"Montage PCR96 Cleanup Kit" (Millipore) avant la réaction de séquence (PCR) et le
séquençage.
- dans le cas de clones, ils ont été cultivés pendant 15-20 h à 37°C sur microplaque
Deepwell de 96 puits, dans 1 ml de milieu LB 2X + ampicilline (voir ci-dessus). Les plaques
ont ensuite été centrifugées, à 4000 rpm pendant 15 min. Les culots cellulaires ont été
conservés à –20°C. Les plasmides ont été extraits et purifiés en utilisant le kit "Montage
Plasmid Miniprep 96 " (Millipore).
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