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Matériel et méthodes après 8 h et 24 h d’incubation. Les cultures "positives" ont été repiquées comme précédemment. 4.4.5 Analyse des produits du métabolisme Ces expériences ont été réalisées par Patricia Pignet (Ifremer, Brest) et Marie-Laure Fardeau (IRD, Marseille). Les analyses ont été réalisées par HPLC et chromatographie phase gazeuse (voir 2.4.3). 4.4.6 Influence de la phase gazeuse Les mélanges gazeux ont été réalisés grâce à un équipement de la société Air Liquide. La phase gazeuse initiale des milieux de culture (N 2 /H 2 /CO 2 ; 90/5/5) a été remplacée par réalisation d’environ 10 cycles : vide ⇔ addition du mélange gazeux calibré. Les phases gazeuses ci-dessous ont été testées sur des cultures sur milieu GYPS, en présence et en absence de soufre : - N 2 /H 2 /CO 2 90 : 5 : 5 - H 2 /CO 2 80 : 20 - N 2 /CO 2 80 : 20 - N 2 100 Les cultures ont été réalisées à 60°C et suivies après 8 h et après 24 h d’incubation. La tolérance à l’hydrogène a été testée lors d’une première série de cultures où le pourcentage d’hydrogène variait comme indiqué (voir ). H 2 /N 2 100 : 0 H 2 /N 2 90 : 10 H 2 /N 2 75 : 25 H 2 /N 2 50 : 50 H 2 /N 2 25 : 75 H 2 /N 2 10 : 90 Dans une seconde série de cultures (voir ), la souche AT1271 T ainsi que les deux espèces les plus proches, Marinitoga camini et Marinitoga piezophila, ont été cultivées avec trois répétitions sur milieu GYPS à 60°C, 50°C et 65°C respectivement. Les densités cellulaires ont été estimées par comptages après 4 h, 8 h, 12 h, et 24 h d’incubation. H 2 /N 2 100 : 0 H 2 /N 2 80 : 20 H 2 /N 2 60 : 40 H 2 /N 2 40 : 60 H 2 /N 2 20 : 80 H 2 /N 2 0 : 100 La tolérance à l’oxygène a été testée par réalisation des cultures sur un milieu GYPS en présence des concentrations suivantes d’oxygène dans la phase gazeuse: 0, 1, 2, 3, 4 et 5%. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque concentration. La croissance a été détectée par observation microscopique. Ces expériences ont été réalisées par Marie-Laure Fardeau (IRD, Marseille) 126
Matériel et méthodes 4.5 Caractérisation génétique de l’isolat 4.5.1 Détermination du G+C mol% Ces expériences ont été réalisées par Françoise Lesongeur (Ifremer). Pour déterminer le pourcentage de bases guanine et cytosine contenu dans le génome de la souche AT1271 T , l’ADN total est soumis à un chauffage progressif jusqu’à fusion de l’ADN : les double brins se séparent. Les molécules d’ADN bicaténaires ont une absorbance plus faible à 600 nm que les molécules monocaténaires. La mesure de l’augmentation d’absorbance ou cours du chauffage permet de déterminer le Tm (melting temperature ou température de fusion) qui correspond à la température au point d’inflexion de la courbe : absorbance = f (température). La guanine et la cytosine s’apparient par 3 liaisons hydrogène alors que l’adénine et la thymine ne s’apparient que par 2 liaisons hydrogène. La fusion de l’ADN bicaténaire s’effectuera à une température qui sera d’autant plus élevée que le nombre de liaisons hydrogène est élevé. La relation qui lie le Tm et la teneur en G+C est linéaire et déterminée pour des conditions expérimentales données, grâce à 3 ADN de référence (Sigma) choisis pour couvrir une large gamme de G+C% : Clostridium perfringens (36,5 G+C mol %), Escherichia coli souche B (50 G+C mol %) et Micrococcus luteus (72 G+C mol %). Le Tm de la souche décrite est déterminé dans les mêmes conditions expérimentales, puis le G+C mol % est déduit d’une relation linéaire de type Tm = a (G+C mol %) + b établie à l’aide des ADN de référence. Ces expériences ont été réalisées avec un spectrophotomètre Uvikon 940 (Kontron) couplé à un bain-marie Ministat (Huber). Les ADN sont testés à une concentration de 15 µg. mL -1 dans un tampon TE 1X. 4.5.2 Analyse phylogénétique de l’ADNr 16S Le positionnement phylogénétique de la séquence d’ADNr 16S d’un isolat a été réalisé par alignement de cette séquence avec celles des souches décrites les plus proches, entre autres, suivi de la construction d’un arbre phylogénétique, comme décrit au paragraphe 3.7. 127
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