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Matériel et méthodes 4 Description d’une nouvelle espèce de microorganisme Les principaux critères étudiés lors de la caractérisation d’une nouvelle espèce microbienne sont présentés ci-dessous (Tableau 7). Tableau 7 : Caractères phénotypiques et génotypiques déterminés lors de la caractérisation d’une souche microbienne (liste non-exhaustive). Critères phénotypiques Morphologie : - forme de la cellule - taille de la cellule - mobilité - flagelle - type de division cellulaire - coloration de Gram Physiologie : Conditions de croissance (optimales et extrêmes) : - température - pH - salinité Métabolisme : - test de croissance en autotrophie - substrats carbonés et substrats azotés - accepteurs d’électrons - effet de la phase gazeuse - produits du métabolisme Critères génotypiques - détermination du contenu en bases G et C de l’ADN génomique - positionnement phylogénétique : alignement de séquences d’ADNr 16S - hybridation ADN/ADN 4.1 Isolement, conditions et suivi de culture A partir de la culture d’enrichissement à 60°C, un échantillon prélevé à T7 a servi d’inoculum pour trois séries de dilutions successives sur le milieu F1 à 60°C. Le séquençage de l’ADNr 16S d’une souche "isolée" a indiqué la présence d’une nouvelle espèce bactérienne au sein du genre Marinitoga appartenant à l’ordre des Thermotogales (la séquence présentait moins de 97% de similarité avec les deux espèces du genre déjà décrites). Une combinaison d’isolements en milieu liquide et d’isolements sur boîte ont été réalisés avant caractérisation de la souche obtenue, notée AT1271 T , en tant que nouvelle espèce (voir paragraphe 2.5). La croissance de la souche a été testée sur différents milieux de culture couramment utilisés au laboratoire pour la culture des Thermotogales. Les milieux ont été testés en présence et en absence de soufre et de thiosulfate. Le milieu GYPS (Tableau 8) a finalement été choisi pour l’étude de caractérisation et les cultures ont été réalisées à 60°C (température d’enrichissement et d’isolement). 120
Matériel et méthodes Tableau 8 : Composition du milieu GYPS-pH6. Composants Concentrations glucose 5 g. L -1 extrait de levure 0,5 g. L -1 peptone 1 g. L -1 Sea Salts 30 g. L -1 tampon MES 3,9 g. L -1 La croissance de la souche a été estimée par comptage en cellule de Thoma, ou par mesure de la densité optique. Dans ce cas, la concentration cellulaire a été déterminée indirectement par la turbidité du milieu due à la croissance cellulaire. L’absorbance à 600 nm a été mesurée grâce à un spectrophotomètre (Spectronic 401, Milton Roy). Les cultures en tubes de Hungate sur milieu GYPS sans soufre permettent une lecture directe de l’absorbance par insertion des tubes dans le spectrophotomètre, après homogénéisation. La proportionnalité entre l’absorbance à 600 nm et la concentration cellulaire n’est valable que pour une gamme de concentrations cellulaires à définir. Une corrélation a été établie entre l’absorbance à 600 nm et le dénombrement cellulaire par comptage en cellule de Thoma. Bien que la technique de comptage en cellule de Thoma puisse être utilisée en théorie sur une gamme plus large de concentrations cellulaires (à partir de 10 6 cellules. mL -1 , sans limite supérieure), la technique de lecture de l’absorbance sera préférée lorsque de nombreuses mesures de concentration cellulaire sont nécessaires à l’expérimentation. 4.2 Caractérisation morphologique de l’isolat 4.2.1 Microscopie optique La morphologie, le mode de division et la mobilité des cellules ont été déterminés par des observations au microscope à contraste de phase Olympus BX60, aux grossissements X400 et X1000. L’observation des cellules dans des milieux contenant des substrats complexes (e.g. polysaccharides), du soufre ou des précipités minéraux est facilitée par un marquage spécifique des cellules au DAPI et une observation en épifluorescence (voir 2.4.2). 4.2.2 Détermination du Gram Les cellules fixées sont colorées au cristal violet et à l’iode, puis traitées à l’alcool. Les cellules à Gram positif (peptidoglycane très épais) conservent une couleur violette après ce traitement. Les cellules à Gram négatif (peptidoglycane fin, espace périplasmique et membrane externe) sont décolorées par l’alcool et apparaissent roses après une contre- 121
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