THESE Anne POSTEC DiversitÃƒÂ© de populations microbiennes ...

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Matériel et méthodes 3.8 Hybridation sur cellules totales (Whole cell hybridization) Ces expériences ont été menées par Françoise Lesongeur (Ifremer). Les hybridations ont été réalisées sur lame Teflon ou sur filtre. Les sondes oligonucléotidiques (Eurogentec) ont été utilisées seules (simple hybridation) ou ensemble (double hybridation) : la sonde ARCH915 (5’-GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT-3’) marquée à l’indocarbocyanine (Cy3) est spécifique des archées, la sonde EUB338 (5’-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3’) marquée avec la fluorescéine-isothiocyanate (FITC) est spécifique des Bacteria. ‣ Hybridation sur filtre Après fixation (voir 2.4.1), les cellules stockées dans un tampon PBS/éthanol 50% (v/v) ont été diluées si nécessaire et filtrées sur un filtre blanc en polycarbonate d’une porosité de 0,2 µm (Isopore Membrane Filter, Millipore) déposé sur une membrane de nitrocellulose. Après séchage à température ambiante, les cellules ont été hybridées avec les sondes ARCH915 et/ou EUB338. L’hybridation a été effectuée pendant 2 h à 46°C, après addition sur chaque filtre de 1,5 µL de la sonde ARCH915 et/ou 1,5 µL de la sonde EUB338, chacune à une concentration de 50 ng. µL -1 dans 12 µL de solution d’hybridation. Les filtres ont été rincés 15 min à 48°C dans une solution de lavage appropriée (Tableau 6). Tableau 6 : Composition des solutions d’hybridation et de lavage. Solutions hybridation lavage Sondes ARCH915 EUB338 ARCH915 + EUB338 ARCH915 EUB338 ARCH915 + EUB338 NaCl 5M 360 µL 360 µL 360 µL 700 µL 4,5 mL 1,8 mL Tris HCl 1M 40 µL 40 µL 200 µL 1 mL 1 mL 5 mL EDTA 0,5M pH8 - - - 500 µL - - Formamide 700 µL 200 µL 400 µL - - - SDS 10% 2 µL 2 µL 1 µL 50 µL 50 µL 25 µL Eau MilliQ 898 µL (qsp 2 mL) 1398 µL (qsp 2 mL) 1039 µL (qsp 2 mL) 47,75 mL (qsp 50 mL) 44,45 mL (qsp 50 mL) 43,2 mL (qsp 50 mL) Après l’hybridation, une "contre-coloration" des cellules a été réalisée par ajout de 10 µL de DAPI (4’,6’-diamidino-2-phenylindole) à 1 µg. mL -1 sur chaque filtre, puis rincés à l’eau distillée et à l’alcool 80%. Les filtres ont ensuite été recouverts de Citifluor (Citifluor, UK). L’observation en épifluorescence s’effectue grâce au microscope Olympus BX60 équipé d’une lampe UV et de filtres pour le DAPI (excitation 365 nm, émission 397 nm), le FITC (excitation 492 nm, émission 520 nm) et le Cy3 (excitation 550 nm, émission 570 nm). 118
Matériel et méthodes ‣ Hybridation sur lame Les cellules fixées, stockées dans un tampon PBS/éthanol 50% (v/v), ont été diluées si nécessaire et avant dépôt de 10 µL par puits sur une lame Teflon. Après séchage dans une étuve à 45°C pendant 30 min environ, les lames ont été immergées successivement dans des bains d’alcool aux concentrations croissantes : 50%, 80% et 100% (3 min / bain). Les procédures d’hybridation, de lavage, de marquage au DAPI et d’observation ont été les mêmes que pour le traitement des filtres. 119
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