THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
2.4.3 Techniques analytiques
Deux techniques de chromatographie ont été utilisées pour l’analyse chimique des
cultures : l’HPLC pour l’analyse des acides aminés, sucres et acides organiques, et la
chromatagraphie phase gazeuse pour l’analyse des gaz en sortie du fermenteur.
- HPLC (High Performance Liquid Chromatography) (réalisé par Patricia Pignet, Ifremer)
La chromatographie liquide haute performance est une méthode d'analyse et de
séparation des produits d'un constituant à l'aide d'une phase mobile (l'éluant) le long d'une
phase stationnaire (la colonne). Le modèle Waters 2690 utilisé comprend une pompe et un
injecteur automatique. Chaque prélèvement de culture (0,5 – 1 mL) a été centrifugé 10 min à
10000 rpm afin d’éliminer les cellules. Le surnageant peut être stocké à 4°C, avant l’analyse
par HPLC. Les protéines du surnageant sont précipitées à l’acide 5-sulfosalicylique pendant
une nuit à 4°C, puis éliminées par centrifugation. Le surnageant récupéré est ensuite utilisé
directement pour l’analyse des sucres, des acides organiques linéaires et aromatiques. A la
différence des sucres et acides organiques, l’analyse des acides aminés nécessite une
étape préparative de dérivation. Une solution d’éthanol / eau / triéthylamine (2/2/1) est
ajoutée au surnageant. L’ensemble est séché sous vide dans un évaporateur concentreur
(Speedvac ® ), puis mis en présence d’une solution de dérivation éthanol / eau / triéthylamine /
phényl-isothiocyanate (7/1/1/1). Après 10 min à température ambiante, l’échantillon est à
nouveau séché dans les mêmes conditions. La dérivation consiste à greffer un groupement
phényl-thiocarbamyle, afin de permettre la détection aux UV lors de l’analyse HPLC. Les
conditions et les produits utilisés pour l’analyse HPLC sont ceux décrits dans la méthode
PicoTag de la société Waters (WAT007360). Les conditions de l’analyse sont décrites dans
le tableau 2.
Tableau 2 : Conditions de l’analyse HPLC des acides aminés, sucres et acides organiques.
Molécule analysée Colonne / Température Eluant, débit Détection
Acides aminés C18 / 47°C
Gradient ternaire UV : 254 nm
(NovaPack WAT 052840, Waters) (WAT007360) (UV 486, Waters)
Sucres et acides Exclusion H + / 60°C
H 2 SO 4 9 mM Réfractométrie
organiques linéaires (polyspher OAKC 1.51270, Merck) 0,35 mL. min -1 (réfractomètre 410,
Acides organiques
aromatiques
Exclusion H + / 65°C
(28352, Chrompack)
Waters)
H 2 SO 4 4,5 mM UV : 210 nm
0,5 mL. min -1 (UV 486, Waters)
- Chromatographie phase gazeuse :
Les gaz en sortie du fermenteur ont été directement analysés en utilisant un microchromatographe
de modèle MTI M200 (SRA Instruments). L’hydrogène, le CO 2 et le H 2 S ont
été détectés par conductivité thermique, mais non quantifiés. L’hydrogène a été détecté
après passage sur une colonne à tamis moléculaire (Molecular Sieve) à 30°C, avec l’argon
comme gaz vecteur. Le CO 2 et le H 2 S ont été détectés par passage sur une colonne
PoraplotU à 100°C, avec l’hélium pour gaz vecteur.
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