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Matériel et méthodes Une cheminée active (fumeur noir) a été collectée par le ROV (robot Victor ou Remote Operated Vehicle) et remontée à la surface dans une boîte étanche décontaminée. A bord, la cheminée a été sous-échantillonnée en huit fractions en fonction de leur structure minéralogique (Figure 18c). Chaque sous-échantillon a été broyé dans une enceinte anaérobie (La Calhene, France) et stocké dans des flacons sérum remplis d’eau de mer stérile et contenant 0.5 mg. L -1 de Na 2 S. Après agitation vigoureuse, un mélange équivolume des huit sous-échantillons noté AT2E1-8 a été réalisé afin de représenter l’ensemble de la cheminée. Cet échantillon AT2E1-8 a fait l’objet d’une analyse moléculaire basée sur l’étude du gène de l’ARNr 16S, et a servi d’inoculum à l’ensemble des cultures d’enrichissement réalisées au cours de ma thèse. 2 Techniques de culture et conditions d’enrichissement 2.1 Milieu d’enrichissement "F1" Le milieu F1 est un milieu riche, à base d’eau de mer, contenant des sources organiques complexes (extrait de levure, casaminoacides), des sucres, des sels et minéraux ainsi que du soufre (Tableau 1). C’est un milieu peu sélectif conçu pour cultiver le plus grand nombre de micro-organismes. Ce milieu a servi pour toutes les expériences de culture d’enrichissement, en flacon (culture en batch) et en fermenteur gas-lift (culture en continu). Tableau 1 : Composition du milieu "F1" modifié d’après le milieu SME (Raven et al. 1992, Sharp & Raven 1997, Stetter et al. 1983). Sources organiques complexes Composants (g ou mL). L -1 extrait de levure (Difco) casaminoacides 1 g (Difco) 0.5 g Sucres 1 glucose 0.4 g dextrine 0.4 g D(+)galactose 0.2 g dextrane 0.2 g glycogène 0.1 g pyruvate acétate 0.2 g 0.1 g Sels NaCl 28 g et minéraux solution de sels de magnésium 2 10 mL solution A 3 1 mL solution B 4 1 mL solution C 5 1 mL solution D 6 1 mL Vitamines solution de vitamines 7 0.5 mL Indicateur 8 solution de résazurine (1 mg mL -1 ) 0.5 mL Tampon 9 PIPES 6,05 g Soufre 10 3 g ou 10 g 88
Matériel et méthodes 1 Tous les sucres sont fournis par Sigma. 2 Solution stock de sels de magnésium (par litre) : MgSO4, 7 H 2 O, 180 g et MgCl 2 , 6 H 2 O, 140 g. 3 Solution A (par litre) : MnSO 4 , 4 H 2 O, 9 g; ZnSO 4 , 7 H 2 O, 2.5 g; NiCl 2 , 6 H 2 O, 2.5 g; AlK(SO 4 ) 2 , 12 H 2 O, 0.3 g; CoCl 2 , 6 H 2 O, 0.3 g et CuSO 4 , 5 H 2 O, 0.15 g. 4 Solution B (par litre): CaCl 2 , 2 H 2 O, 56 g; NaBr, 25 g; KCl, 16 g; KI, 10 g et SrCl 2 , 6 H 2 O, 4 g. 5 Solution C (par litre) : K 2 HPO 4 , 50 g; H 3 BO 3 , 7.5 g; Na 2 WO 4 , 2 H 2 O, 3.3 g ; Na 2 MoO 4 , 2 H 2 O, 0.15 g; et Na 2 SeO 3 , 0.005 g. 6 Solution D (par litre): FeCl 2 , 4 H 2 O, 10 g dans une solution d’acide chlorhydrique 1M, qsp 1l. 7 La composition de la solution de vitamines a été précédemment décrite (Sharp & Raven 1997). 8 La résazurine est un indicateur de l’état de réduction et permet de s’assurer visuellement du maintien des conditions d’anaérobiose : oxydée bleue → oxydée à 50% rose → réduite incolore. Cet indicateur s’utilise pour des pH compris entre 6 et 8. 9 Le PIPES (acide piperazine-N, N’-bis-2-ethanesulfonique) est un tampon utilisable pour une gamme de pH de 6,1 à 7,5. Il est présent dans les milieux pour culture en flacon (en bioréacteur, le pH est régulé en continu). 10 Le soufre colloïdal a été utilisé pour les cultures en bioréacteur (pour éviter de colmater les tuyaux). 2.2 Cultures en flacon 2.2.1 Verrerie Les cultures en milieu liquide peuvent être réalisées dans des flacons pénicilline de 25, 50 ou 100 mL qui sont généralement remplis respectivement avec 10, 20 et 50 mL de milieu de culture. Les flacons sont bouchés par un septum en caoutchouc (butyl) et sertis par une capsule en aluminium. Les tubes de Hungate d’un volume total de 20 mL contiennent généralement 6 mL de milieu et sont également bouchés par un septum. Ils sont par exemple utilisés pour réaliser des séries de dilution dans un procédé d’isolement de souche, ou pour suivre par absorbance une croissance microbienne. Les cultures en grand volume (250 mL à 2 L) sont effectuées dans des flacons sérums. La verrerie est stérilisée au four Pasteur, 3h à 150°C, avant utilisation pour cultures. 2.2.2 Préparation des milieux : stérilisation et répartition en anaérobiose La stérilisation des milieux peut s’effectuer de différentes manières : - par autoclavage : 20 min à 121°C dans l’autoclave, - par tyndallisation : deux périodes de 30 min à 100°C dans l’autoclave, séparées par une période de refroidissement complet. La tyndallisation est utilisée pour la stérilisation des milieux contenant du soufre qui est sensible à la température, 89
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