THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
(AcNa 3M, pH 5,2) dont le rôle anti-chaotropique favorise la précipitation de l’ADN (volume
AcNa 3M = 1/10è du volume de solution aqueuse contenant l’ADN après extraction).
L’ADN est récupéré par centrifugation 35 min à 10 000 g. Le culot d’ADN est séché à
l’air à température ambiante, repris dans de l’eau MilliQ stérile ou du tampon TE 1X ( 10 mM
Tris/HCl, 2 mM EDTA, pH 7.5), et stocké à 4°C.
- contrôle : une migration de l’ADN par électrophorèse permet de contrôler la qualité
de l’ADN extrait, de visualiser une éventuelle dégradation, et d’en estimer la quantité. On
réalise un gel d’agarose 0,8% dans du TAE 1X contenant 0,8 µg. mL -1 de bromure d’éthidium
(BET). La migration s’effectue pendant 30 min à 90V : l’ADN chargé négativement migre
vers l’anode. Un marqueur, mélange de fragments d'ADN de tailles connues, migre
parallèlement à l’ADN étudié et sert de référence de taille. Le BET s’intercale entre les bases
de la molécule d’ADN et permet de visualiser les ADN dans le gel sous UV (Fluor-S-
MultiImager de BioRad).
3.2 Amplification des gènes par PCR
Cette technique a été employée à plusieurs étapes de l’analyse moléculaire, pour
amplifier des gènes d’ADNr 16S à partir :
- d’ADN totaux, extraits de la cheminée hydrothermale ou de cultures d’enrichissement, en
vue d’une séparation des différents fragments amplifiés par DGGE ou clonage,
- de fragments d’ADNr 16S, extraits de gel DGGE ou clonés,
- d’ADNc obtenus par RT-PCR,
- d’ADN totaux de souches isolées en vue d’une identification de la souche par séquençage.
‣ Le milieu d’amplification contient :
- Tampon 10X (Qbiogen)* 5µL (1 X final)
- dNTPs (Eurogentec, 20 mM total) 2µL (200 µM final pour chaque)
- Amorce sens 100 pmol
- Amorce anti-sens 100 pmol
- Taq polymérase (Qbiogen, 5U. µL -1 ) 0,25 à 0,5 µL
- Matrice ADN ≈ 100 ng
- Eau MilliQ stérile QSP 50µL
*Le tampon (Qbiogen) contient 10 mM de Tris-HCl pH9, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl 2 ,
0,1% de Triton X 100 et 0,2 mg. mL -1 de BSA (Bovin Serum Albumin).
Pour amplifier des fragments clonés, les cellules d’E. coli transformées sont
prélevées d’une colonie sur boîte, remises en suspension dans 200 µL d’eau stérile, et 2 µL
de cette suspension sont ajoutés au mélange d’amplification.
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