THESE Anne POSTEC Diversité de populations microbiennes ...

Matériel et méthodes
1 Tous les sucres sont fournis par Sigma.
2 Solution stock de sels de magnésium (par litre) : MgSO4, 7 H 2 O, 180 g et MgCl 2 , 6 H 2 O, 140 g.
3 Solution A (par litre) : MnSO 4 , 4 H 2 O, 9 g; ZnSO 4 , 7 H 2 O, 2.5 g; NiCl 2 , 6 H 2 O, 2.5 g; AlK(SO 4 ) 2 , 12
H 2 O, 0.3 g; CoCl 2 , 6 H 2 O, 0.3 g et CuSO 4 , 5 H 2 O, 0.15 g.
4 Solution B (par litre): CaCl 2 , 2 H 2 O, 56 g; NaBr, 25 g; KCl, 16 g; KI, 10 g et SrCl 2 , 6 H 2 O, 4 g.
5 Solution C (par litre) : K 2 HPO 4 , 50 g; H 3 BO 3 , 7.5 g; Na 2 WO 4 , 2 H 2 O, 3.3 g ; Na 2 MoO 4 , 2 H 2 O, 0.15 g;
et Na 2 SeO 3 , 0.005 g.
6 Solution D (par litre): FeCl 2 , 4 H 2 O, 10 g dans une solution d’acide chlorhydrique 1M, qsp 1l.
7 La composition de la solution de vitamines a été précédemment décrite (Sharp & Raven 1997).
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La résazurine est un indicateur de l’état de réduction et permet de s’assurer visuellement du
maintien des conditions d’anaérobiose : oxydée bleue → oxydée à 50% rose → réduite incolore. Cet
indicateur s’utilise pour des pH compris entre 6 et 8.
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Le PIPES (acide piperazine-N, N’-bis-2-ethanesulfonique) est un tampon utilisable pour une gamme
de pH de 6,1 à 7,5. Il est présent dans les milieux pour culture en flacon (en bioréacteur, le pH est
régulé en continu).
10 Le soufre colloïdal a été utilisé pour les cultures en bioréacteur (pour éviter de colmater les tuyaux).
2.2 Cultures en flacon
2.2.1 Verrerie
Les cultures en milieu liquide peuvent être réalisées dans des flacons pénicilline de
25, 50 ou 100 mL qui sont généralement remplis respectivement avec 10, 20 et 50 mL de
milieu de culture. Les flacons sont bouchés par un septum en caoutchouc (butyl) et sertis par
une capsule en aluminium. Les tubes de Hungate d’un volume total de 20 mL contiennent
généralement 6 mL de milieu et sont également bouchés par un septum. Ils sont par
exemple utilisés pour réaliser des séries de dilution dans un procédé d’isolement de souche,
ou pour suivre par absorbance une croissance microbienne. Les cultures en grand volume
(250 mL à 2 L) sont effectuées dans des flacons sérums. La verrerie est stérilisée au four
Pasteur, 3h à 150°C, avant utilisation pour cultures.
2.2.2 Préparation des milieux : stérilisation et répartition en anaérobiose
La stérilisation des milieux peut s’effectuer de différentes manières :
- par autoclavage : 20 min à 121°C dans l’autoclave,
- par tyndallisation : deux périodes de 30 min à 100°C dans l’autoclave, séparées par une
période de refroidissement complet. La tyndallisation est utilisée pour la stérilisation des
milieux contenant du soufre qui est sensible à la température,
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