cache

25
3. ปริมาณ thiobarbituric acid (TBA) reactive compounds (ดัดแปลงวิธีการของ Hodges
et al., 1999)
TBA-reactive compounds หรือ malondialdehye (MDA) เปน secondary end product
จากกระบวนการ oxidation ของ polyunsaturated fatty acids (PUFA) ใชเปนตัวชี้วัดการเกิด lipid
oxidation การวัดปริมาณ MDA ไมสามารถวัดไดโดยตรง แตจะวัดการเกิดปฏิกิริยากับ TBA แต
เนื่องจากในเนื้อเยื่อพืชมีสารประกอบที่รบกวนการเกิดปฏิกิริยา ไดแก สารพวกแอนโทไซยานิน
และสารอื่น จึงมีการปรับปรุงวิธีการสกัดและการคํานวณสารใหมีความแมนยําถูกตองมากขึ้น
โดยนําเนื้อเยื่อของใบพืชมาสกัดดวย trichloroacetic acid (TCA) ความเขมขน 5% อัตราสวน 1
ตอ 10 แลวบดละเอียดดวยเครื่องปนละเอียด (homiginizer; Polytron PT2100, Switzerland) ขนาด
เสนผาศูนยกลางหัวปน 1.7 มิลลิเมตร และตกตะกอนดวยเครื่องปนเหวี่ยง (centrifuge; Jouan KR
22i, France) ความเร็ว 10,000g อุณหภูมิ 4 o ซ นาน 15 นาที นําสวนใส (crude extract) ปริมาตร 2
มิลลิลิตร ทําปฏิกิริยากับสารละลาย TCA ความเขมขน 20% (-TBA) และ TCA ความเขมขน
20% ที่มี TBA ผสมอยู 0.65% (+TBA) ในปริมาตรที่เทากับปริมาตรของสวนใส ผสมใหเขากัน
นําไปตมในน้ําเดือดอุณหภูมิ 100 o ซ นาน 20 นาที แลวนําไปแชในอางน้ําแข็ง นาน 10 นาที กอน
นําไปตกตะกอนดวยเครื่องปนเหวี่ยงอีกครั้ง ที่ความเร็ว 3,000g นาน 10 นาที นําสวนใสไปวัดคา
การดูดกลืนแสงดวยเครื่องวัดคาการดูดกลืนแสง (spectrophotometer; Genesys 10-UV, USA) ที่
ความยาวคลื่น (Abs) 440 532 และ 600 นาโนเมตร (nm) คํานวณหาปริมาณของ TBA-reactive
compounds หรือ malondialdehye (MDA) ดังสมการ
A = [(Abs 532 +TBA - Abs 600 +TBA ) - (Abs 532 -TBA – Abs 600 -TBA ]
B = [(Abs 440 +TBA – Abs 600 +TBA ) 0.0571]
MDA equivalents (nmol.mL -1 ) = (A-B/157000)10
4. ปริมาณสารประกอบฟนอลิกทั้งหมด (total free phenolics) (ดัดแปลงจาก Singleton et al., 1999)
ทําการสกัดตัวอยางใบพืชดวย เมททานอลความเขมขน 80% อัตราสวน 1 ตอ10 นําไป
บดละเอียดและตกตะกอนดวยเครื่องปนเหวี่ยง นําสวนใสมาทําปฏิกิริยากับ Folin reagent (Sigma,
Germany) และสารละลายโซเดียมคารบอเนต เขมขน 20% เรงปฏิกิริยาโดยอุนในอางน้ํา (water
bath) ที่ปรับอุณหภูมิ 40 o ซ นาน 30 นาที แลวแชในอางน้ําแข็งนาน 10 นาที ทิ้งไวใหเย็นกอน