cache

36
4.4 การสังเคราะห cDNA จาก RNA (cDNA synthesis)
นําสารละลาย RNA ที่สกัดได จํานวน 1 μg มากําจัด DNA ปนเปอนดวยชุด
สารละลาย RNase-free DNase I (Fermentas, USA) ตามวิธีการที่ระบุโดยบริษัทผูผลิต ทําการ
จําลอง RNA สายเดี่ยว เพื่อใหไดผลิตภัณฑ cDNA สายสั้นๆ จํานวนมาก โดยใชชุดสําเร็จรูป
Omiscript Reverse Transcriptase (Qiagen, Germany) โดยใช 18 μL RNA ที่ผานการกําจัด DNA
บนเปอนแลว ตามวิธีการที่ระบุโดยบริษัทผูผลิต ทําการตรวจเช็ค cDNA ที่ได โดยใชเปนสาย
ตนแบบ (template) ในการสรางยีนเปาหมาย ตอจาก ไพรเมอร ของ house keeping gene (18S)
ดวยเครื่อง PCR แยกขนาดของ DNA ใน 0.8% agarose gel ยอมดวย EtBr ตรวจภายใตกลอง UV
จะปรากฏแถบเหนือ DNA มาตรฐานที่ 250 bp ตัวอยางที่ไมเกิด PCR product ตองทําการ
สังเคราะห cDNA หรือสกัด RNA ใหม
4.5 การเพิ่มปริมาณชิ้นสวนของยีนเปาหมาย
นํา cDNA ที่ไดมาทํา PCR reaction โดยนําไพรเมอรแบบไมเฉพาะจํานวน 1 คูใสลง
ในหลอด PCR เติมสารละลาย PCR (Qiagen, Germany) ปริมาตรรวม 25 μL ประกอบดวย 2.5
μL 10x buffer , 1.5 μL 3 mM MgCl 2 , 0.5 μL 10 mM dNTP, 5 μL 10 μM primer Forward, 5 μL
10 μM primer Reverse , 0.125 μL taq polymerase, 1 μL template หรือ cDNA และ double
deionized water นําใสเครื่อง PCR โดยตั้งอุณหภูมิและเวลาสําหรับการทําปฏิกิริยาของยีน LOX
และ PPO (ใชอุณหภูมิและเวลาที่แตกตางกันในสวนวงเล็บ) ดังนี้
ชวงที่ 1 อุณหภูมิ 94 o ซ นาน 3 นาที
ชวงที่ 2 อุณหภูมิ 94 o ซ นาน 30 วินาที
อุณหภูมิ 55 o ซ นาน 1 นาที (54 o ซ นาน 30 วินาที)
อุณหภูมิ 72 o ซ นาน 1 นาที (72 o ซ นาน 40 วินาที) ทําซ้ําจํานวน 35 รอบ
ชวงที่ 3 อุณหภูมิ 72 o ซ นาน 10 นาที
ทําการตรวจชิ้นสวน DNA ดวย 0.8% agarose gel ดวยเครื่องอิเล็กโตรโฟริซิส และ
ยอมดวย EtBr ตรวจภายใตกลอง UV กรณีที่มีผลิตภัณฑปรากฏมากวา 1 แถบตองทําการแยกชิ้น
DNAโดยการตัดเจลภายใตแสง UV นําเจลที่ไดมาสกัด DNA ใหบริสุทธิ์ดวยชุดสําเร็จรูป QIA
quick gel extract (Qiagen, Germany)