cache

28
6.2 การวัดกิจกรรมของเอนไซม
นํา crude extract ที่ไดมาทําปฏิกิริยากับสารตั้งตน (substrate) ทําการวัดคาการ
ดูดกลืนแสงที่มีความสัมพันธกับการสรางผลิตภัณฑที่เกิดขึ้นหรือปริมาณสารตั้งตนที่ลดลง
เนื่องจากกิจกรรมของเอนไซม ดังนี้
6.2.1 กิจกรรมเอนไซม LOX ดัดแปลงจากวิธีของ Sovrano et al. (2006)
เตรียมสารผสม substrate ใน volumetric flask ขนาด 25 มิลลิลิตร (mL)
ประกอบดวย linoleic acid 10 ไมโครลิตร (μL) น้ํากลั่น 4 mL สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด
เขมขน 0.1 N ปริมาตร 1 mL และ Tween 20 ปริมาตร 5 μL ผสมใหเขากัน กอนปรับปริมาตรเปน
25 mL การวัดกิจกรรมของเอนไซม โดยทําปฏิกิริยาในหลอดแกวใส ประกอบดวย substrate 100
μL และ 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8) ปริมาตร 1.85 mL ผสมใหเขากันดวยเครื่องเขยา
(vortex mixer) เติม crude extract ปริมาตร 50 μL ผสมใหเขากันดวยเครื่องเขยาอยางรวดเร็ว แลว
วัดการเปลี่ยนแปลงของคาการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้นตอนาที ที่ความยาวคลื่น 234 nm
6.2.2 กิจกรรมเอนไซม CAT APX และ GPX ดัดแปลงจากวิธีของ Ali et al. (2005)
วัดกิจกรรมของเอนไซมทั้งสามชนิด จากการทําปฏิกิริยารวมระหวาง
สารละลายไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H 2 O 2 ) กับสารตั้งตนหรือเอนไซมที่ความยาวคลื่นแตกตาง
กันดังนี้
1. กิจกรรมของเอนไซม CAT ปริมาตรรวมของสารละลายในหลอดทดลอง
เทากับ 3 mL ประกอบดวยบัฟเฟอร phosphate เขมขน 50 mM (pH 7.0)ปริมาตร 150 μL ผสมกับ
crude extract ปริมาตร 100 μL ผสมใหกันแลวเติม H 2 O 2 เขมขน 30 mM ปริมาตร50 μL (ความ
เขมขนของ H 2 O 2 ในหลอดทดลองเทากับ 10 mM) กิจกรรมของ CAT วัดจากการสลายตัวของ
H 2 O 2 (extinction coefficient 39.4 mM cm -1 ) ที่ความยาวคลื่น 420 nm
2. กิจกรรมของเอนไซม APX ปฏิกิริยาประกอบดวย สารละลาย ascorbic
acid เขมขน 0.5 mM เตรียมใน phosphate buffer ใช crude extract ปริมาตร 100 μL และเติม H 2 O 2
ใหไดความเขมขนของ H 2 O 2 ในหลอดทดลองเทากับ 0.1 mM กิจกรรมของ APX วัดการเกิด