cache

32
มิลลิเมตร ทําปายขนาดเล็กดวยกระดาษ ระบุชื่อของตัวอยางหรือรหัส นําชิ้นเนื้อเยื่อและปายแชลง
(Fix) ในสารละลาย 50% FAA นาน 1 วัน ที่อุณหภูมิหอง แลวนําไปผานขั้นตอนการดึงน้ําออก
(dehydrate) ดวย TBA series ที่ความเขมขน 50% 70% 85% 95% และ 100% (3:1 TBA:100%
EtOH) ใชเวลาแชเนื้อเยื่อ 10-12 ชั่วโมง ในแตละความเขมขน หลังจากแชใน 100%TBA จนครบ
เวลา เทสารเกาออกเติม absolute TBA ทิ้งไวประมาณ 12 ชั่วโมง เปลี่ยนสาร absolute TBA ใหม
แชซ้ําตออีก 12 ชั่วโมง จากนั้นยายเนื้อเยื่อลงในหลอด Eppendrof แลวเติม liquid paraplast
ปลอยใหแข็งตัว เปดฝาตัวอยางนําไปเก็บไวในตูอบ ประมาณ 2 วัน แลวทําการเปลี่ยน paraplast
ใหมทุกวัน เปนเวลา 3 วัน จึงยายเนื้อเยื่อลงในบลอกพลาสติกที่มีอะลูมิเนียมฟอลยขึ้นรูป จัดชิ้น
เนื้อเยื่อใหอยูในระนาบที่ตองการ ปลอยใหแข็งตัว แชตัวอยางในน้ําแข็ง กอนนําไปตัดตามขวาง
ดวย เครื่องตัดเนื้อเยื่อแบบมือหมุน (rotary microtome; MH335, Germany) ความหนาของชิ้น
เนื้อเยื่อ 8 ไมครอน ยอมสีสไลดดวย toluidine blue (Sekai, 1973) ตรวจเช็คการเปลี่ยนแปลง
ลักษณะองคประกอบของเซลล ภายใตกลองจุลทรรศนที่กําลังขยาย 100 เทา
การทดลองที่ 4 ศึกษาการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวของกับการเกิดสีน้ําตาลในใบพืชสกุลกะเพรา
การศึกษาการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวของกับการเกิดสีน้ําตาลในใบพืชสกุลกะเพรามี
ขั้นตอนการดําเนินงานดังตอไปนี้
4.1 การออกแบบไพรเมอร ตามขั้นตอนตอไปนี้
4.1.1 สืบคนขอมูล nucleotide ในฐานขอมูล NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
โดยใชชื่อที่มีความเฉพาะเจาะจงกับสิ่งที่ทําการศึกษามากที่สุด ซึ่งใชสองคําคือ lipoxygenase หรือ
polyphenol oxidase และคําวา chilling หรือ low temperature ตรวจเช็ครายละเอียดของผลที่ไดวา
เปนยีนแบบ full length หรือ partial รายละเอียดของยีน การตีพิมพในวารสาร และคัดเลือกที่เรา
สนใจเปนยีนหลัก
การออกแบบไพรเมอรแบบเฉพาะเจาะจง (specific primer) โดยคัดลอกลําดับ
เบสของยีนหลัก นําไปเทียบคู (alignment) ในสวน nucleotide blast (blastn) เลือกยีนที่มีความ
เหมือน (identity) ของนิวคลีโอไทดใน DNA กับฐานขอมูล มากกวา 85% จํานวน 5-7 ชนิด
คัดลอกลําดับเบสของยีนเหลานั้น เพื่อไปตรวจสอบหาบริเวณอนุรักษ (conserve region) ถาผล
ยีนที่ไดจาก blastn มีเปอรเซ็นตความเหมือนต่ําหรือมียีนที่มีความเหมือน 100 เปอรเซ็นต เพียง 1-