cache
cache
cache
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
34<br />
กอนทําการสกัด และอุนสารสกัดบัฟเฟอร ในอางน้ํา อุณหภูมิ 65 o ซ เปนเวลา 10 นาที กอนใส<br />
เนื้อเยื่อพืช สวนการเตรียมบัฟเฟอร SSTE ประกอบดวย 1.0 M NaOH, 0.5% SDS, 10 mM<br />
Tris-HCl (pH 8.0) และ 1 mM EDTA (pH 8.0) เตรียมสารละลายทุกชนิดดวย RNAase-free water<br />
4.2.2 บดเนื้อเยื่อใบในไนโตรเจนเหลวดวยโกรงใหละเอียด ชั่งจํานวน 1 กรัมใสใน<br />
หลอด centrifuge (หลอดกนกลม) ที่ปราศจาก DNA และ RNA (RNase/DNase free) เติมสกัด<br />
บัฟเฟอรจากขอ 4.1.1 ปริมาตร 15 mL ผสมใหเขากันดวยเครื่องเขยา ที่ความเร็วรอบสูงนาน 1<br />
นาที ปนละเอียดใน เครื่องบดผสมสาร นาน 1 นาที เติมสารละลาย SEVAX (chloroformisomyalcohol;<br />
24:1 v/v) ในปริมาตร 15 mL ตกตะกอนดวยเครื่องปนเหวี่ยงตะกอน ความเร็ว<br />
7,000g นาน 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4 o ซ เก็บสวนใส ใสหลอดใหม เติมสารละลาย SEVAX<br />
ปริมาตรเทาเดิม ตกตะกอนซ้ําดวยสภาพเดิม เก็บสวนใสกรองผาน Mira cloth ที่ฆาเชื้อแลว ลงใน<br />
หลอดกนกลม เติมสารละลาย LiCl ความเขมขน 8 M ปริมาตร 1 ใน 3 ของปริมาตรรวมของสวน<br />
ใสที่อยูในหลอด เพื่อตกตะกอน RNA นําหลอดไปเก็บในอุณหภูมิ 4 o ซ นาน 1 คืน แลวจึงนําไป<br />
ปนเหวี่ยงที่ความเร็ว 12,000g ที่ 4 o ซ นาน 20 นาที เก็บสวนตะกอน เพื่อนําไปทําการสกัดใน<br />
ขั้นตอนตอไป<br />
4.2.3 นําตะกอนที่ไดมาละลายดวยบัฟเฟอร SSTE อุนที่อุณหภูมิ 65 o ซ นาน 10 นาที<br />
ปริมาตร 500 μL ดูดสารละลายใสในหลอด Eppendrof ขนาด 1.5 mL ผสมสารใหเขากันดวย<br />
เครื่องเขยา เติม SEVAX ปริมาตรเทากับปริมาตรรวมของสวนใสที่อยูในหลอด และผสมใหเขา<br />
กันแลวนําไปตกตะกอนดวยเครื่องปนเหวี่ยงตกตะกอน ที่ความเร็ว 12,500g นาน 5 นาที ที่ 4 o ซ<br />
เก็บสวนใสในหลอด Eppendrof หลอดใหม เติม absolute ethanol ที่เย็นจัด ปริมาตรเทากับ<br />
ปริมาตรรวมของสวนใสในหลอด คว่ําหลอดกลับไปมา นําไปเก็บไวที่ -70 o ซ นาน 30 นาที แลว<br />
นําไปตกตะกอนซ้ําที่ความเร็ว 12,000g นาน 20 นาที ที่ 4 o ซ เทสวนใสทิ้ง ลางตะกอนดวย 70%<br />
ethanol ปริมาตร 0.5 mL ผสมใหเขากันดวยเครื่องเขยา นําไปตกตะกอนอีกครั้งที่ความเร็ว<br />
12,000g นาน 5 นาทีที่ 4 o ซ เทสวนใสทิ้ง คว่ําหลอดบนกระดาษซับแหงหรือทําใหแหงใน<br />
vacuum desiccator jar จากนั้นละลายตะกอนดวยน้ํา DEPC ปริมาตร 20 μL ดูดสารละลาย RNA<br />
สวนหนึ่งไปตรวจสอบและวัดปริมาณ RNA ที่สกัดได และนําสารละลาย RNAไปแชในตูแชแข็ง<br />
ที่อุณหภูมิ -70 o ซ จนกวาใชงาน
Change language