cache

38
ชิ้น DNA 2 แถบ แถบบนสุดคือ DNA ของพลาสมิด แถบลางเปนชิ้น DNA เปาหมาย ซึ่งมีขนาด
หรือจํานวนเบสใกลเคียงกับที่ไดทําการออกแบบไพรเมอรไว
4.6.5 ตรวจสอบลําดับเบสของชิ้นสวนยีนเปาหมาย ดวยเครื่อง Automatic DNA
sequencer โดยใชบริการของ DNA Technology ศูนยพันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพ
แหงชาติ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน นําผลลําดับเบสที่ไดมาตรวจวิเคราะห
โดยใชโปรแกรม Blast aligment (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
4.7 การตรวจสอบการแสดงออกของยีน OcLOX ดวย semi-quantitative RT-PCR
4.7.1 สกัด RNA จากเนื้อเยื่อใบที่คาดวามีการแสดงออกของยีนเปาหมาย คือใบที่เริ่ม
เกิดอาการสะทานหนาว เปรียบเทียบกับใบที่ไมเกิดอาการสะทานหนาว (ใบเก็บรักษาที่ 12 o ซ) ใน
ใบออนและใบแก ตรวจสอบคุณภาพและปริมาณ ทําความสะอาด ตามขั้นตอนที่กลาวมาแลวและ
เช็ค cDNA ที่ไดดวยทํา PCR reaction กับไพรเมอรยีนควบคุมหรือ house keeping gene (18S) ที่
ผานการโคลนจากเนื้อเยื่อจากดอกกลวยไม มีลําดับเบสดังนี้ Forward 5 / -GGACTATGGCCGT
TTAGGC-3 / และ Reverse 5 / -CCGGACCATTCAATCGGTAG-3 / (accession no. AB027309)
4.7.2 นํา cDNA ของตัวอยางที่ผานการตรวจสอบวาสามารถเกิดผลิตภัณฑจาก PCR
reaction มาทดสอบหาจํานวนรอบที่เหมาะสม ในการ PCR reaction กับไพรเมอรยีนควบคุม
(18S) โดยการหยุดการทํางานของเครื่อง PCR แบบชั่วคราวและนําหลอด PCR ออกมาเมื่อครบ
จํานวนรอบที่ตองการทดสอบที่ 18 21 25 และ 30 รอบ ตรวจสอบผลิตภัณฑที่ไดดวย เครื่องอิ
เล็กโตรโฟริซิส ยอมดวย EtBr ตรวจภายใตกลอง UV บน 0.8% agarose gel เลือกจํานวนรอบที่ไม
ทําใหแถบมีความสวางจนเกินไป (อิ่มตัว) จากการทดลองใชจํานวน 27 รอบที่อุณหภูมิ 45 o ซ โดย
ตั้งอุณหภูมิและเวลาสําหรับการทําปฏิกิริยา ดังนี้
ชวงที่ 1 อุณหภูมิ 94 o ซ นาน 3 นาที
ชวงที่ 2 อุณหภูมิ 94 o ซ นาน 30 วินาที
อุณหภูมิ 45 o ซ นาน 30 วินาที
อุณหภูมิ 72 o ซ นาน 30 วินาที ทําซ้ําจํานวน 27 รอบ
ชวงที่ 3 อุณหภูมิ 72 o ซ นาน 5 นาที