cache

39
4.7.3 นํา cDNA ของทุกตัวอยางมาทําปฏิกิริยา PCR กับยีนควบคุม(18S) นํา PCR ที่
ไดมาตรวจสอบดวยเครื่องอิเล็กโตรโฟริซิส บน 0.8% agarose gel และยอมดวย EtBr ตรวจ
ภายใตกลองยูวี แถบที่ไดจะอยูในระนาบเดียวกัน ผลที่ไดรับแตละตัวอยางมีความสวางของแถบ
ไมเทากัน ตองทําการปรับลดปริมาณหรือเจือจาง cDNA ที่ใช ทําปฏิกิริยา PCR ใหมและปรับ
ปริมาณ cDNA จนกวา แถบที่ไดจากปฏิกิริยา PCR มีความสวางใกลเคียงกันมากที่สุดในทุก
ตัวอยางที่ตองการทดสอบ ซึ่งแสดงวาทุกตัวอยางมีการแสดงออกของยีนควบคุมเทากัน
4.7.4 นําตัวแทน cDNA มาหนึ่งตัวอยางมาทดสอบหา annealing temperature ที่
เหมาะสมตอการทําปฏิกิริยา PCR ของไพรเมอรเฉพาะของยีน OcLOX โดยใชเครื่อง gradient
PCR โดยทดสอบที่ 60, 55, 50 และ 45 o ซ พบวาที่ 50 o ซ ไดผลิตภัณฑ ที่มีความสวางของแถบ
ชัดเจนที่สุดจากนั้นนําทุกตัวอยางที่ตองการทดสอบมาทําปฏิกิริยา PCR reaction ในหลอด PCR
ประกอบดวย 2.5 μL 10x buffer , 1.5 μL 3 mM MgCl 2 , 0.5 μL 10 mM dNTP, 5 μL 10 μM
primerForward , 5 μL 10 μM primerReverse , 0.125 μL taq polymerase, 1 μL template หรือ
cDNA และ 18.375 μL DEPC water มีปริมาตรรวม 25 μL โดยใชปริมาณหรือความเขมขนของ
cDNA แตละตัวอยางเทากันกับยีนควบคุมที่ไดทดสอบไวแลว แตเพิ่มจํานวนรอบมากกวายีน
ควบคุม เนื่องจากยีน OcLOX มีการแสดงออกนอยกวา ตั้งอุณหภูมิและเวลาสําหรับการทํา
ปฏิกิริยา ดังนี้
ชวงที่ 1 อุณหภูมิ 94 o ซ นาน 3 นาที
ชวงที่ 2 อุณหภูมิ 94 o ซ นาน 30 วินาที
อุณหภูมิ 50 o ซ นาน 1 นาที
อุณหภูมิ 72 o ซ นาน 1 นาที ทําซ้ําจํานวน 30 รอบ
ชวงที่ 3 อุณหภูมิ 72 o ซ นาน 10 นาที
ตรวจวิเคราะหผลผลิต PCR ดวยเครื่องอิเล็กโตรโฟริซิส บน 0.8% agarose gel และ
ยอมดวย EtBr ตรวจภายใตกลอง UV แถบที่ไดจะอยูในระนาบเดียวกัน ต่ํากวาชิ้น DNA มาตรฐาน
ที่ 500 bp ซึ่งมีขนาดประมาณ 470 bp เปรียบเทียบความสวางของแถบที่ได ทําการสกัด RNA ใหม
และทําตามขั้นตอนตาง ๆ ที่กลาวมาทั้งหมด เปรียบเทียบความสวางของแถบที่ไดหรือการ
แสดงออกของยีนเปาหมายโดยเปรียบเทียบกับยีนควบคุม (18S)