cache

77
การทดลองที่ 5 ผลของอุณหภูมิต่ําตอการแสดงออกของยีนที่ควบคุมการผลิตเอนไซมที่เกี่ยวของ
กับการเกิดอาการสะทานหนาวของพืชสกุลกะเพรา
5.1 การแสดงออกของยีนที่ควบคุมการผลิตเอนไซม lipoxygenase (LOX) ในใบแมงลัก
(Ocimum x citriodorum)
ทดสอบ degenerate primer ที่มีการออกแบบไวแลว คูที่ไดผลิตภัณฑและสามารถ
โคลนไดคือ FNui (forward LOX) 5 / -ATG GAK RAC HGA TGA RGA RTT YG-3 / (Promyou,
2007) และ PrepR1(reverse LOX) 5 / -CCA RTG RCT NAT KAG YTG-3 / (Boonsiri, 2007) หลัง
การทํา PCR และ โคลนได มีขนาด 470 คูเบส ซึ่งประกอบดวยแถบ 2 แถบ (ภาพผนวกที่ 1) จึงทํา
การแยกเจลดวยชุดสําเร็จรูป QIAquick gel extract (Qiagen, Germany) แถบบนตั้งชื่อ LOX4 A
และแถบลางใหชื่อวา LOX4B ทําการโคลนทั้ง 2 แถบ แตโคลนไดเฉพาะ LOX4 B จึงทําการ
ออกแบบ specific primer จํานวน 2 เสน Forward LOX4B 5 / -TCC AGG AGT TTC CAC CAA
AG-3 / และ Reverse LOX4B 5 / -GTA CCC GGA TTC GTT CAC TG-3 / หลังการทํา PCR ได
product ขนาด 468 คูเบส (ภาพผนวกที่ 2) ทําการตรวจเช็คพบวาเปนโคลนใหมไดตั้งชื่อวา OcLOX
(EU140837) นําลําดับเบสเขาโปรแกรม Blastn พบวาลําดับเบสมีความคลายคลึงกับยีน LOX ของ
Fragaria x ananassa (AJ578035) 73%, Cucumis sativus (AJ271161) 72%, Lycopersicon
esculentum (AY008278) 69% และ Brassica napus (AY162142) 69% ซึ่งมีลําดับของนิวคลีโอไทด
และลําดับกรดอะมิโน ดังภาพที่ 23 และ 24
1 CGAAAAATGC TTGCTGGAGA CAACCCGGTT ATCATTCGAC GCCTCCAGGA GTTTCCACCA
61 AAGAGCAAAT TAGACCCTCA AAAATATGGG AATCATGACA GCACCATCAC AAGGGAGCAC
121 ATCGAGAAAA ACATGAACGG CCTCTCTGTT GAAGAGGCAA TAGAGAAGAA CAAGTTGTTC
181 ATACTAGAAC ATCACGACGC GCTGATGCCA CACCTGAGAC GAATCAACAC GACAGCAACA
241 AAGACTTACG CCACCAGAAC TCTCCTCCTA CTTCAAGACG ACGGCACGCT GAAGCCCCTA
301 GCGATCGAGC TGAGCTTGCC ACATGAAGAC GGAGACTCGT GTGGAGCAGTGAGCAAAGTG
361 ATCACTCCGT GCCACGACGG CGGCATCCAA GGCACCATCT GGCAGCTGGC GAAAGCCTAC
421 GCTGCAGTGA ACGAATCCGG GTACCACCAA CTCATCAGCC ACTGGAAT 468
ภาพที่ 23 ลําดับนิวคลีโอไทดยีน OcLOX ที่แยกไดจากใบแมงลัก ความยาว 468 คูเบสและใช
ออกแบบโพรบและไพรเมอร สําหรับ semi-PCR