Guia Clínica de l'HIV 2003 - Sida Studi

uiz.qxd 4/03/03 06:34 Página 339pot quantificar les proporcions que poden existir de variants wild type omutant si és que ambdues hi són presents.Determinació de seqüències del genoma individualsd’una població viralEl material amplificat per PCR es sotmet a clonatge molecular generalmenten Escherichia coli. Com a vectors poden emprar-se els pGEM ambpolilinkers de diferent composició de dianes de restricció. Poden clonarseDNAs amplificats després d’adequar els seus extrems (roms o adhesius)per a la seva unió al vector. Generalment, es sol sotmetre a anàliside 15 a 20 clons per a l’avaluació de la població viral que alberga unpacient infectat. Aquest mètode està indicat per a l’estudi de poblacionsminoritàries virals.Hibridació diferencial (Point mutation assay)Aquest mètode, adaptat a l’HIV per Kaye i col·laboradors, es basa essencialmenten l’extensió d’un iniciador o encebador unit a un suport sòlid. En lesreaccions d’extensió, un dideoxinucleòtid marcat amb S o biotina s’uneixa la cadena de DNA que s’està sintetitzant en l’extrem 3’-OH enfront delnucleòtid que pot o no conferir resistència a un fàrmac específic. La informaciósemiquantitativa s’obté mesurant la quantitat de fluorescència oradiació emesa pels genotips wild type o mutants.Aquestes tècniques d’hibridació utilitzant sondes marcades amb isòtopsradioactius es van començar a realitzar l’any 1995 i permeten quantificarvariants virals wild type o mutants en mostres de plasma. Actualmentaquests mètodes han millorat considerablement, ja que han introduït tècniquesde marcatge no radioactiu utilitzant reactius, com la biotina i la fosfatasaalcalina, que permeten detectar i quantificar els productes de PCRcolorimètrica o quimiolmuniscentment en microplaques. A diferència delsmètodes inicials, que no poden quantificar petites quantitats de virus mutants,els actuals permeten l’anàlisi de mostres on existeixen poblacionsminoritàries d’espècies virals en un mateix individu.339