La composizione chimica del protoplasma;

15Supponendo anche di avere delle cellule dello spessore adatto per l’osservazione nonostante questonon potrebbero sopravvivere a lungo ad una osservazione visto che il microscopio non è il loroambiente ideale ed è anche per questo motivo che si usano cellule coltivate in vitro.La morte della cellula rappresenta un problema per l’osservazione in quanto i tessuti vanno incontroad una rapida degenerazione falsando il risultato dell’osservazione, per questo motivo la cellula deveessere opportunamente preparata.La preparazione avviene attraverso una serie di passaggi che sono:- fissazione: consiste nell’uccidere la cellula con un procedimento che non rovini i tessuti coni cosiddetti cross leganti che stabiliscono legami covalenti fra le molecole.Alcuni esempi di queste sostanze sono: gli aldeidi (formaldeide, formalina eglutoraldeide) e l’alcool etilico, l’alcool metilico, l’acetone e il cloroformio.Generalmente vengono usati in soluzione acquosa.Si usano anche dei procedimenti fisici anche se meno frequentemente che sono: usodi calore e congelamento.- inclusione: per procedere all’affettamento della cellula è necessario renderla rigida e questo siottiene con l’inclusione. Tale processo consiste nel far penetrare in tutti gli interstizidella cellula la paraffina (bagno di paraffina) che a 50 - 60 °C è liquida mentre atemperatura ambiente solidifica. Non essendo però compatibile con l’acqua ènecessario disidratare il campione con soluzioni di alcool a concentrazioni crescenti.La paraffina non interagisce però con l’alcool per cui bisogna usare degli intermediaricome il toluolo o il benzolo.Vi è però un problema, molte molecole lipidiche vengono eliminate durante iltrattamento così ultimamente al posto della paraffina si usano dei monomeri chevengono in seguito polimerizzati cioè induriti.A questo punto il preparato può essere affettato con l’uso di microtomi.- colorazione: si usano coloranti in soluzioni acquose e, per questo è necessario rimuovere laparaffina con benzolo (sparaffinate) poi, bisogna reidratare progressivamente ilcampione. Ora si può procedere alla colorazione.I coloranti si legano a diverse componenti della cellula spesso sfruttando leinterazioni fra molecole acide e molecole basiche.A questo punto si può “montare” il preparato chiuso tra due vetrini di basso spessore e conl’aggiunta di alcune resine sintetiche che conservano il campione.Microscopio elettronico a trasmissione;Nel microscopio elettronico al posto di radiazioni luminose si utilizzano fasci di elettroni.La risoluzione del microscopio elettronico è dipendente dal voltaggio al quale lavora, la tensione ècompresa tra 10.000 e 100.000 Volt.Per l’osservazione biologica si usano regolarmente tensioni intermedie dell’ordine dei 50.000 Volt;con questa tensione si ottiene una risoluzione teorica di 0,2 nm mentre quella reale è leggermenteinferiore: 2 - 5 A.Lo spessore dei preparati deve essere inferiore a quello dei preparati per la microscopia ottica, infattideve essere pari a 70 nm.Il microscopio elettronico è costituito da una colonna di dimensioni considerevoli (altezza di 2 m.)sulla sommità della quale è posto il catodo costituito da un filamento di tungsteno che resoincandescente emette elettroni.Questi stessi elettroni attraversano l’anodo sottostante che serve a focalizzare il fascio.